·耐盐型 DNA 特异性核酸内切酶

·用于降解双链和单链 DNA

·产生具有 5′-磷酸和 3′-羟基末端的短链寡核苷酸

·不含 RNase 

    DNase I-XT（耐盐）特别适用于：

·降解体外转录反应中的 DNA 模板

·去除 RNA 样品中残留的基因组 DNA

 DNase I-XT（耐盐）是基于 DNase I 改造的耐盐型 DNA 核酸内切酶，可非特异切割 DNA，产生具有 5′-磷酸和 3′-羟基末端的二核苷酸、三核苷酸和寡核苷酸产物 (1,2)。DNase I-XT（耐盐）作用于单/双链 DNA、染色体，以及 RNA:DNA 杂交链上的 DNA。当盐浓度>50 mM 时，不耐盐型 DNase I（无 RNase）（NEB #M0303）的活性会受到抑制，但 DNase I-XT（耐盐）（NEB #M0570）在 50-100 mM 盐浓度范围活性最佳，盐浓度达到 200 mM 时，可维持 65% 活性，300 mM 时，仍有~40% 活性。

图 1：DNase I-XT（耐盐）在盐浓度> 100 mM，能高效降解 DNA

在等摩尔的 DNase I (NEB #M0303) 和 DNase I-XT（耐盐）(NEB #M0570) DNase 活性比较中，DNase I-XT（耐盐）展示出更高的耐盐特性。检测方法为：在 1X DNase I 反应缓冲液中，消化标记有荧光和淬灭基团的发夹 dsDNA 底物（35 nt），荧光强度反映出不同盐浓度条件下的酶活（如图所示）。结果显示：DNase I 活性随着盐浓度的增加而下降，而耐盐的 DNase I-XT 在高达 300 mM 盐浓度中仍保持活性。

图 2：DNase I-XT（耐盐）能够更完全的去除 IVT 反应和 RNA 中的 DNA 

20 μl 体外转录产物用以下三种方法检测去除残留 DNA 的效果：1) 无 DNase I；2) 2 U TURBO^® DNase 或 3) 2 U DNase I-XT（耐盐），37°C 条件下孵育 15 分钟。分别使用 Monarch RNA 纯化试剂盒（500 µg）（NEB #T2050）纯化，以无核酸酶水（50 µl）洗脱。使用 Luna 通用探针法 qPCR 预混液（NEB #M3004）通过 qPCR 检测 DNA 残留水平。将每个样品的平均 Cq 值与标准曲线（灰色）进行比较，以评估可 PCR-扩增 DNA 的百分比。TURBO DNase 和 DNase I-XT（耐盐）的使用都不需要对 IVT 反应产物进行稀释，但是，DNase I-XT（耐盐）对 IVT 反应中的 DNA 模板去除更彻底，难以通过 qPCR 检测到。

图 3：DNase I-XT（耐盐）有效去除 RNA 粗提产物中的残留 DNA

RNA 粗提样本用以下四种方法检测去除残留 DNA 的效果：1) 无 DNase I；2) 在 DNase I-XT 反应缓冲液中加入 DNase I-XT（耐盐）(2 U, NEB #M0570)；3) 在 DNase I 反应缓冲液中加入 DNase I (2 U, NEB #M0303)；4) 在 TURBO DNase 反应缓冲液中加入 TURBO DNase (2 U, ThermoFisher) ，37°C 条件下孵育 15 分钟。使用 Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒 (NEB #E3005) 和人类或小鼠 Actin 外显子引物，通过（+/- RT）qPCR 检测对残留的基因组 DNA (gDNA) 进行定量。以 qPCR（无反转录，仅扩增DNA）与 RT-qPCR（有反转录，同时扩增 DNA 和 RNA）平均 Cq 值的差值评估 DNase 去除 DNA 的效果。结果显示：对于 RNA 粗提产物中的残留 gDNA，DNase I-XT（耐盐）比 TURBO DNase 去除效果更彻底。