人肿瘤坏死因子TNF-α试剂盒产品说明书
人肿瘤坏死因子TNF-α简介：
肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α , TNF-α)是一种具有多功能的细胞因子，在炎症反应、细胞免疫、细胞凋亡和脂质代谢中发挥重要作用。人 TNF-α前体由 233 个氨基酸组成(26 kDa)，其中包含由76 个氨基酸残基组成的信号肽，在 TNF 转化酶 TACE 的作用下，切除信号肽，形成成熟的 157 个氨基酸残基的 TNF-α(17 kDa)。在胞外结构域中，人 TNF-α与恒河猴的氨基酸序列具有 97%的同一性，与牛、犬、棉鼠、马、猫、小鼠、猪和大鼠 TNF-α序列具有 71%-92%的同一性。TNF-α来源极广泛，体内多种细胞如单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、内皮细胞和角质细胞等均可产生和释放 TNF-α。TNF 受体有 2 种，I 型(TNFR1)分子量为 55 kD，Ⅱ型(TNFR2)为 75 kD，在多种细胞中表达，介导细胞凋亡的主要是 TNFR1。TNF-α以三聚体的形式与靶细胞上 3 分子 TNFR 结合而使受体激活。
TNF-α具有广泛的生物学活性，可以杀伤或抑制肿瘤细胞，诱导正常细胞增殖分化，抗感染，促进 IL-1、IL-2 和 IL-6 的产生和分泌，诱发炎症反应，激活嗜中性粒细胞，调节 MHCⅡ类抗原的表达，提高中性粒细胞的吞噬能力。TNF-α也参与许多病理过程，包括哮喘、克罗恩病、类风湿性关节炎、神经病理性疼痛、肥胖、2 型糖尿病、感染性休克、自身免疫和癌症等。
试剂盒组成：
储存条件：
检测原理:
金畔 QuantiCyto® ELISA试剂盒采用双抗体夹心法：抗人TNF-α单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的人TNF-α会与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人TNF-α抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素，生物素与亲和素特异性结合；抗人TNF-α抗体与结合在单抗上的人TNF-α结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有人TNF-α，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450 nm处测OD值，人TNF-α浓度与OD450值之间呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中人TNF-α的浓度。
试验所需自备试验器材 (不提供，但可协助购买) :
1. 酶标仪(450 nm波长滤光片)
2. 进口品牌高精度加液器及一次性吸头：0.5-10 ul, 2-20 ul, 20-200
ul, 200-1000 ul。
3. 37 ℃恒温箱, 双蒸水或去离子水，坐标纸等。
可协助代购相关产品，请咨询。
标本收集:
1. 收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。
2. 血浆抗凝剂推荐使用EDTA。避免使用溶血，高血脂标本。
3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。
4. 标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20 ℃，-70 ℃电冰箱内，避免反复冻融，3-6月内检测。
5. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数)。
注意事项:
1. 试剂盒使用前请保存在2-8 ℃。复溶后的标准品若未用完，请废弃。
2. 浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使液体沾到管壁或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000转/分离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。
3. 从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，微加热至40℃使结晶完全溶解后再配制洗涤液。（加热温度不要超过50 ℃）使用时洗涤液应为室温。
4. 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）。请提前咨询上海金畔生物科技有限公司。
5. 充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使用最低频率)，如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。
6. 在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测。
7. 试验中所用的试管和吸头均为一次性使用，严禁在不同的液体之间混用！否则将影响试验结果。
8. 试验中请穿着试验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液标本时，请按国家生物试验室安全防护条列执行。
9. 如果分次使用，请根据需要量配制各组分，以免配制过多造成浪费而影响后续试验。剩余板孔请用封板胶纸封住，放回铝箔袋中,2个月内用完。
检测前准备工作:
1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。
2. 用双蒸水将20×浓缩洗涤液稀释成1×工作液。未用完的放回4 ℃。
3. 标准品: 开盖前1000rpm离心1min。加入标准品&标本通用稀释液1.0 ml至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为1000 pg/ml)。然后根据需要进行稀释。(建议标准曲线使用以下浓度：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml)。0 pg/ml即空白孔。复溶标准品原液(1000 pg/ml）若未
用完的请废弃。
4. 生物素化抗体工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20分钟，用生物素化抗体稀释液将30×浓缩生物素化抗体稀释成1×工作液。当日使用。若实验次数过多导致生物素化抗体量不足，可向金畔公司单独购买生物素化抗体。（须提供抗体批号）
5. 酶结合物工作液：按当次试验所需要的用量，使用前20分钟，用酶结合物稀释液将30×浓缩酶结合物稀释成1×工作液。当日使用。
若实验次数过多导致浓缩酶结合物量不足，可向金畔公司单独购买浓缩酶结合物。（须提供酶结合物批号）
标准品稀释方法图例：
以500 ul/管为例，用标准品&标本通用稀释液将复溶后的标准品母液进行倍比稀释，具体稀释方法如下图，也可根据实际用量来稀释，如200 ul/管。
洗涤方法:
1. 自动洗板机：要求注入的洗涤液为350 ul，注入与吸出间隔30－60秒。洗板5次。
2. 手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350 ul，静置30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干。洗板5次。 操作步骤:
1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压实自封条，密封口袋，放回4 ℃。
2．空白孔加标准品&标本通用稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100 ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37 ℃恒温箱，避光孵育90分钟。
3．提前20分钟准备生物素化抗体工作液。
4．洗板5次。
5．空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100 ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，37 ℃恒温箱，避光孵育60分钟。
6．提前20分钟准备酶结合物工作液。避光室温(22-25 ℃)放置。
7．洗板5次。
8．空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100 ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，37 ℃恒温箱，避光孵育30分钟。
9．打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。
10．洗板5次。
11．加入显色底物(TMB)100 ul/孔，37 ℃恒温箱，避光孵育15分钟。
12．加入反应终止液100 ul/孔, 混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。
13. 实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束。
建议保存酶标板框，以备下次或者今后试验使用。
结果判断:
1. 每个标准品和标本的OD值应减去空白孔的OD值。
2. 以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，手工绘制或用软件绘制并选取最佳拟合曲线，推荐使用二次多项式方程拟合。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
3. 若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。
灵敏度、特异性和重复性:
● 灵敏度：最小可测人TNF-α达7.8 pg/ml(8次独立重复实验平均值)。
● 特异性：本试剂盒特异性识别天然和重组人TNF-α。与以下细胞因子等无明显交叉反应。
● 重复性：板内，板间变异系数均<10%。
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