胚胎tau蛋白及焦谷氨酸β淀粉样肽 Aβ介绍

胚胎 tau 蛋白

野生型胚胎Tau蛋白(0N3R) 

– 单体（SPR-490）

– 原纤维（SPR-491）

StressMarq 提供野生型 Tau 0N3R 单体 (目录号 SPR-490) 和PFF (目录号 SPR-491). AFM 图片 (右边) 显示出明显的卷曲，而在 TEM (左图) 中难以观察到.

胚胎 Tau 0N3R 前体原纤维(目录号 SPR-491)聚集

胚胎 Tau 0N3R 单体 (目录号 SPR-490) 形成原纤维的硫磺素T 聚集测试。 图像显示加入原纤维后 ThT 信号明显增强，在测试之前原纤维进行了5轮超声处理。每孔加入了10uM 肝素和 1mM DTT。

焦谷氨酸β淀粉样肽 Aβ（SPR-492）

焦谷氨酸β淀粉样蛋白 3-42 前体原纤维 • AD病人脑斑块种15-45% 的Abeta都是焦 谷氨酸β淀粉样肽 • 焦谷氨酸Aβ 3-42 显示出比全长Aβ 1-42 更强的聚集倾向和神经毒性 • 下一代 AD 治疗药物研发的靶向目标

左图: 焦谷氨酸β淀粉样蛋白 3-42 前体原纤维（目录号SPR-492）的 TEM。 负染色透射电子显微镜图像在 80 Kv 下在碳涂层的 400 目铜网格上使用磷钨酸和乙酸双氧铀染色获得。比例尺 =100 nm. 方法: 用于透射式电子显微镜检测的样品根据“direct application method”(Doane and Anderson 1987) 来制备。

中图: 焦谷氨酸β淀粉样蛋白 3-42 前体原纤维（目录号SPR-492）的 AFM。 将1.0 mg/mL样品在 dH2O 中稀释至 0.1 mg/mL 置于新鲜切割的云母上，清洗、干燥并以轻敲模式进行原子力显微镜分析。展示的图片来自 StressMarq Biosciences Inc 内部测试

右图: 焦谷氨酸β淀粉样蛋白 3-42 前体原纤维（目录号SPR-492）的免疫印迹，抗体是抗β淀粉样蛋白 6E10 抗体。相比于重悬于 2% DMSO然后接着在 SDS-PAGE 上跑的单体, 原纤维中没有单体, 从 37 kDa往上才有信号， 在浓缩胶位置有明显信号。分子量梯 = Precision Plus Dual Xtra 预染色的标准品。

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Tau蛋白聚集和阿尔茨海默氏症

什么是Tau蛋白?

Tau是神经元中稳定微管的一类蛋白。Tau蛋白主要存在于轴突当中, 但是也可以在树突和其他神经元部分出现。在一些神经衰退疾病中，例如tau蛋白病，tau蛋白从微管上脱落下来，在脑中形成了不溶性聚集物。

Tau和阿尔茨海默氏症

阿尔茨海默氏症 (AD) 是目前最常见的神经衰退疾病之一, 威胁着 10% 的 65岁以上的老人1。这个疾病是根据一位德国科学家Alois Alzheimer命名的, 他在1907 年于一个过世的痴呆症患者的脑中发现了出现于神经元中的缠结的纤维2。AD 的一个患病特征就是含有淀粉样肽beta的斑块和含有tau的神经纤维缠结(NFTs)。

阿尔茨海默氏症患者的海马体免疫组化显示神经纤维缠结. Patho [CC BY-SA 3.0], 图片来自 Wikimedia Commons

Tau蛋白结构

Tau蛋白易溶解于水溶液中3，没有稳定的二级或三级结构4。Tau蛋白分子结构含有四个区域:  氨基末端，富脯氨酸区域，重复区域，以及羧基末端区域5。Tau蛋白作为一个整体是亲水的.6 在细胞质中游离的tau形状像是“曲别针” , 这个结构使 N 末端和 C 末端都位于重复序列的附近.7

Tau蛋白异构体

表达Tau 蛋白的基因是 MAPT , 位于人17号染色体上。由于tau基因的选择性剪接，成人大脑中有六种异构体。有三种异构体是有三段微管结合重复区域 (3R)，另三种是有四段微管结合重复区域 (4R)8。异构体的大概有352-441个氨基酸，分子量为60-74 kDa.5。在人胎儿大脑中只有最短的异构体被表达9。

Tau蛋白病

在神经衰退疾病中，tau蛋白聚集形成神经纤维缠结 (NFTs) 的一类被称为tau蛋白病，包括 AD, 皮质基底节变性, 额颞叶痴呆, 额颞叶变性, 进行性核上性麻痹, 以及PD10。有研究表明在亨廷顿舞蹈症病人中也可见到tau蛋白的聚集增加，包括棒状沉淀11。

Tau蛋白聚集

图表显示了tau蛋白从微管上脱离，导致了微管的解体。脱落下来的tau蛋白聚集形成寡聚体，成对螺旋丝，最后形成了神经纤维缠结。

翻译后修饰

Tau的翻译后修饰 (PTMs) 非常多，包括磷酸化、糖基化、硝化、O-GlcNAc糖基化、乙酰化、氧化、泛素化、SUMO化以及甲基化12。这些 PTM 调控着tau蛋白对微管蛋白的亲和力13。高度泛素化的tau蛋白就被发现于 AD 和其他tau蛋白病当中,12 赖氨酸和其他一些PTM 损害tau的功能并促进了单体的聚集10。在tau蛋白病转基因的小鼠大脑中可检测到K280的乙酰化，但是在对照组小鼠中检测不到14，这个结果暗示了tau蛋白的乙酰化修饰可能与tau蛋白病相关。虽然tau蛋白有非常多的翻译后修饰，但是目前被研究最多的还是磷酸化。

Tau 蛋白的过度磷酸化

Tau蛋白的20%的氨基酸都可以是潜在的磷酸化位点8。通常情况下，tau蛋白的微管结合区域是带正电的，因此可以吸引带负电的微管。当这个微管结合区域高度磷酸化以后，它就失去了正电量，从微管蛋白上脱离下来，不再具有结合稳定微管的能力了。接下来造成微管蛋白的失效，而且高度磷酸化的tau聚集沉淀，对神经细胞有毒性，这些后果共同造成了神经衰退病因15。

成对螺旋丝

两个高度磷酸化的tau蛋白单体因为结构的改变，可以结合形成二聚体8。这个二聚体化由重复区2 和 3 的六元胜肽相互作用开始，接下来导致tau蛋白的寡聚化反应16。寡聚体进一步形成具有双螺旋纽带结构的成对螺旋丝 (PHFs)17。在 PHFs 中的 tau 蛋白比tau蛋白单体带更多的负电量，因此无法与带负电的微管蛋白结合或有效地稳定微管 18。没有了tau蛋白的稳定，微管结构网就很容易解体，导致神经元无法再正常工作。

神经元纤维缠结

NFTs 是丝状的、不可溶的tau聚集体, 含有增多的 β 折叠结构19，含有聚集的 PHFs. NFT在大脑中的的沉积程度与痴呆的严重程度20和神经元死亡有关21。AD患者中其他形式的tau聚集体包括神经纤维网线 (neuropil threads) 和神经斑块，也会引起神经元的衰退22，然而有些研究表明丝状和纤维状的tau可能对神经元有保护作用，高度磷酸化的tau寡聚体是最具毒性的一种23。

Tau 蛋白的聚集增殖

关于Tau蛋白疾病中tau的聚集增殖机制，有一种假设提出是 “似朊蛋白自我复制繁殖” 。这个机制是tau“种子”或纤维从一个供体细胞转移到一个受体细胞，然后聚集更多内源tau蛋白形成PFFs24。虽然tau蛋白和朊蛋白的增殖方式类似，但是目前不清楚tau是不是和朊蛋白还有其他类似的特征，比如人和人之间传染的可能性25。

Tau 前体纤维原

前体纤维原 (PFFs) 可以诱导人工培养的细胞25和动物活体13中的tau蛋白的聚集，使可溶的单体聚集形成不溶纤维。在表达tau蛋白的细胞中引入少量的tau PFFs就可以引起大量的tau聚集形成丝状包含物类似NFTs27。合成的tau PFFs也可以进入到非神经细胞中聚集tau蛋白形成 NFTs28。

Tau PFFs 可以充当种子，聚集单体形成更大的纤维体。

Tau 截短蛋白

有些研究显示在原代神经元中，全长 tau PFFs 的种子聚集作用比截短的K18蛋白要强28。然而，当截短蛋白和全长 tau蛋白同时在小鼠中表达时，会引起严重的但是可逆的神经毒性29。这可能是由于可溶的、非丝状、高分子量的寡聚体对神经元有毒性29。

Tau 和α-突触核蛋白

超过 50% 的AD 疾病涉及到路易体的形成、β-淀粉样斑块，而PD病人和路易体痴呆病人的脑中经常可见NFTs30。α-突触核蛋白和tau 可以在体外促进单体的纤维化31，tau纤维和α-突触核蛋白在路易体中显示出共同的定位32。α-突触核蛋白PFFs 促进tau蛋白的磷酸化，在体外诱发tau蛋白的聚集33。Tau蛋白和 α-突触核蛋白的相互作用和纤维化可能出现在tau蛋白病和突触核蛋白病中。

未来治疗方式

AD以及其他tau蛋白疾病的几种治疗研究方案都涉及到以tau蛋白为靶点。Tau 的高度磷酸化由蛋白激酶和磷酸酶调控34，针对tau蛋白高度磷酸化的治疗需要抑制tau激酶，修复蛋白磷酸酶 2A, 或者以tau蛋白的O-糖基化为目标靶点35。另外，针对神经炎症的治疗也是一个研究方向，因为神经炎症对tau的增殖也有促进作用15。用tau蛋白抗体免疫小鼠也显示出对疾病恶化有缓和作用36，这表示免疫治疗可能也是一种潜在的治疗方案。

Tau蛋白相关产品

活性 Tau 纤维原

活性 Tau441 (2N4R), P301S 蛋白单体

活性 Tau (K18), P301L 蛋白单体

活性 Tau441 (2N4R), P301S 蛋白前体纤维原PFFs

活性 Tau (K18), P301L 蛋白前体纤维原PFFs

抗-Tau 抗体 (pSer396)

抗-Tau 抗体 (pSer422)

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阿尔茨海默症造模–活体注射Tau蛋白

阿尔茨海默症是一种中枢系统退行性疾病，主要的现象是记忆力下降，认知功能障碍，并出现语言和运动障碍。目前针对阿尔茨海默疾病的研究也非常多，方法主要建立在构建动物模型和细胞模型，根据不同的实验目的，选择合适的模型尤为重要。阿尔茨海默的发病机制复杂，至今仍未阐述清楚，其中比较主流的观点认为神经元纤维缠结的沉积与阿尔茨海默症中认知衰退密切相关，而tau蛋白是重要的组成成分。Tau蛋白广泛分布于中枢神经系统的神经元中，是一种微管相关的蛋白质，可调节微管蛋白的稳定性。在阿尔茨海默症患者大脑中，纤维缠结普遍存在，磷酸化tau蛋白增加了数倍，说明磷酸化tau蛋白聚集对突触和神经元的毒性作用。

StressMarq 可以提供活性 tau蛋白原纤维（ tau PFFs）的生物公司，所有活性 tau蛋白原纤维（ tau PFFs） 都可用于注射活体制作阿尔茨海默疾病模型，制模时间 (30 天) 远远少于传统的基因改造小鼠 (9 个月到 1 年)，是研究阿尔茨海默氏疾病的有效工具。

Tau蛋白相关产品：

Stressmarq研制了活性tau蛋白，这些活性tau蛋白都不含有肝素等添加剂，可以用于研究二硫键在 tau 蛋白聚集中的作用，而且可以用于注射入小鼠/大鼠活体内制作阿尔茨海默疾病模型，30 天可见病理反应。也有文献中体外细胞培养实验表明，外源性的tau蛋白原纤维可能通过内吞作用被细胞内化，并使内源性tau蛋白聚集产生错误折叠的构象。

  Tau蛋白和磷酸化tau蛋白抗体相关产品：

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靶向Tau蛋白单体:治疗干预的潜力

由MAPT基因编码的微管相关蛋白tau主要在神经元中表达，tau蛋白在许多生理过程中发挥重要作用。神经细胞中tau蛋白的异常过度磷酸化和聚集是阿尔茨海默病、帕金森病和许多其他所谓的tauopathies的典型特征，强调了理解、预防或逆转这一过程的必要性。通过靶向tau蛋白进行治疗干预，研究人员希望改善患者的预后，并为目前无法治愈的神经退行性疾病开发有效的治疗方法。

为什么以tau单体为靶点?

正常情况下，tau蛋白是单体的，在成人大脑中以6种不同的亚型(长度为352 – 441个氨基酸)表达1。这些参与调节微管的组装和稳定性，这是轴突生长和突触囊泡运输的关键。然而，在病理条件下，过度磷酸化的tau单体从带负电荷的微管中分离，首先聚集成寡聚体，然后聚集成神经原纤维缠结(NFTs)，进而导致神经元变性2,3。

尽管tau蛋白的病理机制尚未完全了解，但已经提出了几个假说。一种建议是，天然Tau蛋白通过结构转变衍生出的具有种子活性的tau单体可能引发聚集，这表明了阻止这种转化的治疗潜力4。另一种观点认为，溶酶体应激可能刺激种子活性单体tau蛋白释放到细胞外空间，促使研究人员考虑抑制溶酶体胞外作用的治疗用途5。我们也知道，疾病相关的突变可以破坏tau蛋白内具有聚集倾向的VQIVYK基序，因此这可能被证明是一个有价值的治疗靶点6。

tau单体如何用于聚集性分析?

已有各种模型用来研究tau蛋白聚集的过程，其中许多模型依赖于重组tau单体在体外复制聚集组装。一种流行的方法是使用聚集诱导剂，如聚阴离子(如肝素)、脂肪酸(如花生四烯酸)或tau原纤维丝从tau单体中形成聚集物，使用荧光探针硫黄素S(结合丰富的β薄片结构)实时监测聚集物的形成；例如，这允许比较不同tau蛋白异构体、截断的tau蛋白结构域或蛋白质突变体的聚集率3。其他类型的分析旨在研究在各种细胞系中过表达tau单体的影响，同样使用诸如硫黄素S等次级方法来跟踪聚合产物。

用于聚合分析的高质量tau单体

我们研发了一系列的试剂用于神经退行性疾病Tau蛋白的研究。其中包括在大肠杆菌(spr -327)或杆状病毒(spr -473)中表达的人类活性重组Tau441 (2N4R)、P301S突变蛋白单体、人类活性重组Tau441 (2N4R)野生型蛋白单体(spr -479)、人类活性重组Tau (K18)、P301L突变蛋白单体(spr -328)以及人类活性重组Tau (K18) K280缺失蛋白单体(spr -476)。我们的活性人重组截取Tau片段 (AA297-391)蛋白单体dGAE (spr -444)和dGAE C322A (spr -445)，以及活性小鼠重组Tau441 (2N4R)， P301S 突变蛋白单体 (spr -474)补充了这些蛋白。其中许多已通过使用硫黄素T监测聚集得到验证。

硫黄素T是一种荧光染料，可与富含β薄片的结构结合，如tau原纤维中的结构。结合后，染料的发射光谱发生红移，荧光强度增加。硫黄素T发射曲线显示，当截断tau片段(AA297-391) (dGAE C322A)单体与截断tau片段(AA297-391) (dGAE C322A)预形成原纤维(Type 1)结合时，荧光随时间增加(与tau聚集相关)。

REFERENCES

1. Tau-mediated Neurodegeneration and Potential Implications in Diagnosis and Treatment of Alzheimer’s Disease, Wu XL et al, Chin Med J (Engl). 2017 Dec 20;130(24):2978-2990

2. Phosphorylation and Dephosphorylation of Tau Protein During Synthetic Torpor, Luppi M et al, Front. Neuroanat., 06 June 2019

3. Cell-based Models To Investigate Tau Aggregation, Lim S et al, Comput Struct Biotechnol J. 2014 Oct 2;12(20-21):7-13

4. Inert and seed-competent tau- monomers suggest structural origins of aggregation, Mirbaha H et al, Elife. 2018 Jul 10;7:e36584

5. Seeding Activity-Based Detection Uncovers the Different Release Mechanisms of Seed-Competent Tau Versus Inert Tau via Lysosomal Exocytosis, Tanaka Y et al, Front Neurosci. 2019 Nov 21;13:1258

6. Tau local structure shields an amyloid-forming motif and controls aggregation propensity, Chen D et al, Nat Commun. 2019 Jun 7;10(1):2493

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