Luna^® SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒用于 SARS-CoV-2 的实时 RT-PCR 检测

Ÿ   对 2019-nCoV_N1 和 2019-nCoV_N2 靶标以及人源 RNase P 基因进行多重检测，支持高通量检测流程

Ÿ   通过将 RNase P 内标的反向引物设计为跨外显子序列，降低基因组 DNA 的扩增背景

Ÿ   4X 浓度的 RT-qPCR 预混液支持更大的上样量，提高检测灵敏度

Ÿ   Luna 温启动反转录酶和热启动 Taq 酶共同提升反应特异性和功效，可在室温条件下建立体系

Ÿ   预混液中包含热敏 UDG 和 dUTP，防止残留污染

Ÿ   支持混合样品池检测，且不影响灵敏度

Ÿ   欲了解 NEB 如何支持 COVID-19 研究，请点击 COVID-19 research，其中详述了多种 RT-qPCR 病毒检测方案

使用 Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒，在 96 孔板上检测 94 个不同的样本。结果通过荧光通道显示。 

Luna^® SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒经过优化，适用于水解探针法的 SARS-CoV-2 实时 RT-PCR 检测。在同一管中，RNA 首先由反转录酶转化为 cDNA，然后使用 DNA 依赖型 DNA 聚合酶扩增 cDNA，从而可以进行 qPCR 定量。基于探针法的 qPCR / RT-qPCR 原理是利用聚合酶的 5´ → 3´ 外切酶活性，将淬灭的目标特异性探针切断发出荧光，并实时监测荧光值的增加，以测量 PCR 每个循环中的 DNA 扩增。在荧光信号显著超过背景荧光的位置，可以确定 Cq 值。Cq 值可用于评估两个或多个样品的靶基因相对丰度。

图 1：Luna^® SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒组分

图 2：Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒可在一个反应中同时检测两个 N 基因位点和人源 RNase P 基因

A. SARS-CoV-2 的两组引物探针序列源于 CDC 提供，其中探针改为两种荧光标记（N1: HEX, N2: FAM）。

B. RNase P 内标包含 Cy5 标记的探针和重新设计的反向引物。该引物的跨外显子设计，避免了人基因组 DNA（含有 2.4 kb 内含子）的扩增干扰。

SARS-CoV-2 引物/探针混合物包含 SARS-CoV-2 病毒中 N 基因两个区域的引物和探针 [基于美国疾病控制与预防中心（CDC）提供的序列]。两条探针带有不同的荧光标记（N1: HEX;N2: FAM），可在 qPCR 仪器的两个不同通道中同时观测。为了确保检测样品的完整性和无抑制物，还包含一套用于扩增人源 RNase P 基因的内标（IC）引物和探针。该靶基因的反向引物与 CDC 的设计不同，修改为跨外显子序列，以降低残留基因组 DNA 的扩增背景。IC 的扩增可在 Cy5 通道观测。产品同时还提供阳性对照（PC）（含有 SARS-CoV-2 N 基因的质粒）。

该试剂盒包含 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（NEB #M3019），支持更大的上样量和混合样品池检测，对灵敏度和特异性的影响极小。该预混液包含一步法 RT-qPCR 的所有组分，和独特校对参比染料，可与多种 qPCR 仪器兼容，包括需要高 ROX 或低 ROX 参比信号的仪器。独具特色的是：预混液还包含防止残留污染的热敏 UDG 和 dUTP，以及有助于体系建立的无荧光可见示踪染料。该示踪染料与 qPCR 常用荧光基团的光谱没有重叠，因此不会干扰实时检测。

图 3：Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒的检测下限比 TaqPath™1-Step RT-qPCR Master Mix, CG 更低

将下述两种试剂盒进行检测下限（LOD）比较：使用 Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒对 2019-nCoV_N1（HEX）和 2019-nCoV_N2（FAM）进行多重 RT-qPCR 检测，实验设置参照 E3019 产品说明书；使用 TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix, CG 对 2019-nCoV_ N1（FAM）和 2019-nCoV_N2（FAM）进行单重 RT-qPCR 检测，实验设置参照美国疾控中心 2019-nCoV 实时 RT-PCR 诊断指南。实验样品：将 Twist 公司合成的 SARS-CoV-2 RNA 对照 2 掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA 中。实验仪器为 Applied Biosystems^® 7500 Fast 实时荧光定量仪 （96 孔板，20 µl 反应体系）。结果显示 Luna 试剂盒对两个靶标的检测下限为 5 拷贝/反应，而 TaqPath 为 10 拷贝/反应。

图 4：Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒适用于纯化 RNA 的混合样品池检测

通过将一份 2 µl 的模拟阳性样品（10 拷贝的 Twist 合成 SARS-CoV-2 RNA 对照 2 掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA）与四份 2 µl 的模拟阴性样品（仅含 10 ng Jurkat 总 RNA）混合，制备出包含五份样品的混合样品池。将混合样品池（10 µl）与单独样品（2 µl，含 10 拷贝 N 基因和 10 ng Jurkat 总 RNA）进行性能比较。实验仪器为 Applied Biosystems^® 7500 Fast 实时荧光定量仪（96 孔板，20 µl 反应体系）。N1 和 N2 靶标的扩增曲线显示，单独和掺入混合样品池的阳性样品 Cq 值相似。由于混合样品池中人源总 RNA 量是单独样品的 5 倍，因此正如预期，混合样品池 RNase P 基因的 Cq 值更小。

图 5：Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒的检测下限（LOD）

 通过 Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒对多种 SARS-CoV-2 RNA 对照样品中的 2019-nCoV_N1（HEX）和 2019-nCoV_N2（FAM）靶标进行多重 RT-qPCR 检测，获得该试剂盒的检测下限（LOD）。实验样品：将 Twist 公司合成的 SARS-CoV-2 RNA 对照 2 掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA 中（图 A）。两位实验人员同时使用三种仪器进行平行测试（96 孔板，20 µl 反应体系）：Applied Biosystems（ABI）7500 Fast Real-Time instrument、ABI QuantStudio™ 6 Flex Real-Time PCR system，以及 Bio-Rad CFX instrument。结果显示：Twist RNA 的检测下限均为 5 拷贝/反应。此外还测试了其它样品类型（图 B）：SARS-CoV-2 基因组 RNA 源自 ATCC（ATCC® VR-1986D™）、NIST（Fragment 1 – Includes SARS-CoV-2 sequence: 25949-29698 of isolate USA-WA1/2020），以及 SeraCare AccuPlex™ SARS-CoV-2 Verification Panel V2（0505-0132）。上述 RNA 均由 Monarch 总 RNA 小量提取试剂盒（NEB# T2010）提取。所有 RNA 样品均掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA，使用 ABI 7500 Fast Real-Time instrument 检测。假设 RNA 提取的回收率为 100%，则各样品检测下限为：ATCC 的 SARS-CoV-2 基因组 RNA 为 2.5 GE（genomic copy equivalent）、NIST SARS-CoV-2 测试样品为 1×107 倍稀释、SeraCare AccuPlex 样品为 15 拷贝。

图 6：与 TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix CG相比，Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG 对 SARS-CoV-2 N2 靶标的检测性能更好

A. 使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG 对 2019-nCoV_1（HEX）和 2019-nCoV_N2（FAM）进行单重 RT-qPCR，实验设置参照 E3019 产品说明书。B. 使用 TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix, CG 对 2019-nCoV_N1（FAM）和 2019-nCoV_N2（FAM）进行单重 RT-qPCR，实验设置参照美国疾控中心 2019-nCoV 实时 RT-PCR 诊断指南。实验样品：将 Twist 公司合成的 SARS-CoV-2 RNA 对照 2 掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA 中，实验评估了样品 5-log 浓度范围扩增结果。实验仪器为 Applied Biosystems^® 7500 Fast 实时荧光定量仪（96 孔板，20 µl 反应体系）。在上述条件下，Luna 和 TaqPath 对 N1 靶标的扩增结果都很好。对于 N2 靶标，尽管 TaqPath 可检测 10 个拷贝样品，但线性度并不理想，而 Luna 线性度更好，且 Cq 值出现更早。

Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG 结合了热启动 Taq DNA 聚合酶和具有新型温启动活性的反转录酶，可通过基于适配体的可逆抑制来双重控制酶的活性，这种温控活化机制可避免热循环前的非特异引物结合和扩增，从而让室温建立体系更安全。经改造的 Luna 温启动反转录酶具有更高的热稳定性，最佳反应温度为 55°C。

图 7：Luna RT-qPCR 预混液的室温稳定性让实验流程更灵活

使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG 对2019-nCoV_N1（HEX）和 2019-nCoV_N2（FAM）进行单重（SP）和多重（MP）RT-qPCR，实验设置参照 E3019 产品说明书。使用 TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix, CG 对 2019-nCoV_N1（FAM）和 2019-nCoV_N2（FAM）进行单重 RT-qPCR，实验设置参照美国疾控中心 2019-nCoV 实时 RT-PCR 诊断指南。实验样品：将 Twist 公司合成的 SARS-CoV-2 RNA 对照 2 掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA 中，实验评估了样品 5-log 浓度范围（100,000-10 拷贝）的扩增结果。上机前，将 RT-qPCR 反应体系分别室温孵育 0、2、5、24 小时。实验仪器为 Applied Biosystems® 7500 Fast 实时荧光定量仪（96 孔板，20 µl 反应体系）。结果显示 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 预混液孵育 0-24 小时的实验结果一致，而 TaqPath 孵育 2 小时后，Cq值延迟≥1，实验效果随孵育时间的延长而下降。