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定量PCR专用反转录试剂PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)
品牌	Code No.	产品名称	包装量	价格（元）	说明书	数量
Takara	RR047Q	PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)	10 Rxns	￥271
Takara	RR047A	PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)	100 Rxns	￥1,600 ￥650
Takara	RR047B (A × 4)	PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)	100 Rxns × 4	￥6,080

■ 制品内容 (Code No.: RR047A: 20 μl反应×100次量)

1. gDNA Eraser 100 μl 2. 5X gDNA Eraser Buffer*1 200 μl 3. PrimeScript RT Enzyme Mix I*2 100 μl 4. 5X PrimeScript Buffer 2(for Real Time)*3 400 μl 5. RT Primer Mix*4 400 μl 6. RNase Free dH2O 1 ml×2 7. EASY Dilution (for Real Time PCR)*5 1 ml   *1 5X gDNA Eraser Buffer在反转录反应前使用，请务必进行基因组DNA的除去反应。 *2 含有RNase Inhibitor。 *3 含有dNTP Mixture。 *4 含有Oligo dT Primer和Random 6 mers。 *5 制作标准曲线时梯度稀释cDNA或RNA标准品的稀释液。模板cDNA或RNA如果用水或TE Buffer稀释时，由于受Microtube吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结果精度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。本制品不影响反转录和PCR反应，用其稀释后的样品可直接使用。EASY Dilution (for Real Time PCR) (Code No. 9160/9160Q) 也可以单独购买。 注意：EASY Dilution (for Real Time PCR) 请与本公司Real Time PCR试剂组合使用，对于其他公司的同类制品的适用性本公司尚未进行确认。

■ 制品说明

为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但Total RNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组DNA得不到扩增。但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。在这种情况下，我们常常需要对Total RNA样品进行DNase I处理，以除去残存的基因组DNA。而DNase I处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组DNA进行Real Time RT-PCR反应的专用反转录试剂。Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNA Eraser，通过42℃，2 min即可除去基因组DNA。同时由于反转录试剂中含有抑制DNA分解酶活性的组分，经过gDNA Eraser处理后的样品可以直接进行15 min的反转录反应合成cDNA，因此，20 min内即可迅速完成从基因组DNA去除到cDNA合成的全过程。 使用本制品合成的cDNA适用于嵌合法和探针法qPCR分析，可以根据实验目的，选择与TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR820Q/A/B)*、TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR420A/B)*、Probe qPCR Mix (Code No. RR391S/A/B) 组合使用。 *：Takara嵌合法Real Time PCR（qPCR）产品的名称从2017年12月下旬开始，将逐步变更为「TB Green系列」。产品Code、性能和原有产品相比没有变化，请继续放心使用。 产品名称将随新lot的产品逐步变更，产品网页或操作说明书可能会先于产品标签变更，望知悉！   ■ 保存 -20℃。   ■ 试剂盒特长 1. 含有去除基因组DNA的gDNA Eraser，只需2 min即可除去基因组DNA。 2. 只需15 min即可高效合成Real Time PCR反应用模板cDNA，是进行2 Step Real Time RT-PCR反应的理想试剂。 3. 反转录引物使用了Random 6 mers和Oligo dT Primer混合的RT Primer Mix，可以均匀合成样品中的各种cDNA。 4. 本制品提供了TB Green qPCR分析法和探针qPCR分析法各自适合的反应体系，可以根据分析方法选择体系。 TB Green qPCR分析法和探针qPCR分析法区别如下： (1) 反转录反应中RT Primer Mix的用量。 (2) 反转录反应中总RNA的用量。 5. Real Time RT PCR定量需要建立标准曲线，建立标准曲线的条件就是需要将总RNA和反转录cDNA稀释到较低的浓度。如果用水或TE Buffer稀释时，由于模板浓度低不稳定，因而会缩小曲线范围，结果准确度降低。本制品中附加了标准曲线制作用稀释液EASY Dilution (for Real Time PCR) ，将Total RNA或cDNA稀释至低浓度时也能够进行准确稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。   ■ 注意事项 1．使用本制品合成的cDNA与TB Green关联制品组合使用时，建议使用： TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Code No.RR820Q/A/B) TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR420Q/A/B) 以上制品与本制品组合使用，可以得到可信度高的结果。 本制品与TB Green Fast qPCR Mix (Code No. RR430S/A/B) 组合使用时，有时反应性能不好，不推荐使用。 2. 当同时需要进行数次反应时，应先配制各种试剂的混合液 (Master Mix；其中包括RNase Free dH2O、Buffer、酶等)，然后再分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。 3. gDNA Eraser和PrimeScript RT Enzyme Mix I 在使用前要小心地离心收集到反应管底部。由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。同时，要使用精确、量程适合的移液枪，并且不要使Tip插入液面过深，否则会因Tip壁粘着造成损失，而使酶量不足。 4. 5X gDNA Eraser Buffer和5X PrimeScript Buffer 2（for Real Time）在使用前需Vortex振荡混匀，轻轻离心后使用。 5. 分装试剂时务必使用新的枪头 (Tip)，以防止样品间污染。

页面更新：2023-08-10 10:26:45

上海金畔生物科技有限公司代理Takara酶试剂盒全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

RT-PCR试剂盒PrimeScript™ RT-PCR Kit
品牌	Code No.	产品名称	包装量	价格（元）	说明书	数量
Takara	RR014A	PrimeScript™ RT-PCR Kit	50 Rxns	￥1,299
Takara	RR014B (A × 4)	PrimeScript™ RT-PCR Kit	50 Rxns × 4	￥4,682

■ 制品内容 (Code No. RR014A ; 50 次量*1)

PrimeScript RTase (for 2 Step) 25 μl 5 × PrimeScript Buffer 200 μl RNase Inhibitor (40 U/μl) 25 μl dNTP Mixture (10 mM each) 150 μl Oligo dT Primer (2.5 μM) 50 μl Random 6 mers (20 μM) 50 μl TaKaRa Ex Taq HS (5 U/μl) 25 μl 10 × PCR BufferⅡ 250 μl Control F-1 Primer*2 (20 μM) 10 μl Control R-1 Primer*3 (20 μM) 10 μl Positive Control RNA (2 × 105 copies/μl) 20 μl RNase Free dH2O 1 ml   *1 反转录反应20 μl 、PCR反应50 μl体系时可使用50次。 *2 Positive Control RNA用上游引物。 *3 Positive Control RNA用下游引物。

■ 制品说明

PCR (Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应) 是一种使用两条引物在目的DNA序列两侧扩增特异性DNA片段的过程。它是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法，但RNA不能直接被扩增。经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA后，PCR法便可应用于RNA的解析了。目前，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。 PrimeScript RT-PCR Kit是具有良好的延伸性能与高扩增效率的2 Step RT-PCR试剂盒。反转录反应使用了Takara Bio Inc.特别开发的M-MLV由来的新型反转录酶PrimeScript RTase；PCR反应使用了扩增性能良好的Hot Start 型DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS。本试剂盒具有以下优点： 1. 进行高效的RT-PCR扩增。 2. 在标准的RNA反转录反应温度 (42℃) 下，便可使具有复杂结构的RNA进行良好的延伸，可以避免RNA在高温条件下的降解。 3. 能有效抑制非特异性的PCR扩增。 本试剂盒含有反转录反应及PCR扩增反应所需的全部试剂。

■ 各种引物的序列

引物名称 各引物序列 Random 6 mers        pd (N)6 Oligo dT Primer        Takara Bio特别设计的dT区域* Control F-1 Primer        5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′ Control R-1 Primer        5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′

* 该序列和TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0 (Code No. : RR019A/B) 的Oligo dT Adaptor Primer不同，不含有与M13 Primer M4匹配的序列。

■ Positive Control RNA

本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3质粒 (质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4 kb的pBR322来源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四环素基因) 为模板由SP6 RNA聚合酶经体外转录而得到的。

图1. Positive Control RNA：使用Control Primer可以扩增462 bp的DNA片段

■ 保存

-20℃。

■ RNA PCR 的原理

PrimeScript RT-PCR Kit首先用PrimeScript RTase将RNA合成cDNA，再取一部分1st strand cDNA作为模板，由TaKaRa Ex Taq HS进行PCR扩增。将RNA反转录成cDNA的引物可以使用Random 6 mers、Oligo dT Primer或特异性下游引物。

图2. PrimeScript RT-PCR Kit原理图

图3. PrimeScript RT-PCR Kit 的操作流程

■ 特点

RNA模板       适用于所有RNA 扩增片段大小       ～12 kb 反转录酶       PrimeScript RTase (反转录反应最适温度42℃) DNA Polymerase       TaKaRa Ex Taq HS RNase Inhibitor       Kit中含有 合成第一条cDNA链的引物       Random 6 mers、Oligo dT Primer和特异性下游引物

■ 反转录反应时Primer的选择

反转录引物的选择，应结合实验的具体情况，选择以下三种引物，即：Random 6 mers、Oligo dT Primer或特异性下游引物。对没有发夹结构的短链mRNA，上述三种引物都可以使用；一般情况下的反转录引物的选择请参照以下说明。

Random 6 mers   适用于长的或具有Hairpin构造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在内的所有RNA的反转录反应都可使用本引物。 Oligo dT Primer   适用于具有PolyA Tail的RNA。(注意：原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些种类的真核生物的mRNA等不具有PolyA Tail)。 特异性下游引物 (PCR时的下游引物)   必须与模板序列互补，需了解Target序列。

■ 使用注意

1. 当同时需要进行数次RT-PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液，然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。 2. 用PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、TaKaRa Ex Taq HS等酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；分取之前要小心地离心收集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。 3. 酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放入-20℃保存。 4. 为了防止Positive Control RNA分解，应尽量避免反复冻融。有条件的实验室最好保存于-70℃～-80℃。 5. 分装试剂时务必使用新的枪头，以防止样品间污染。

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