·  包含 phi29-XT DNA 聚合酶，该酶是经基因工程改造过的聚合酶，可在较短反应时间内获得高产量的产物，并改善热稳定性和灵敏度

 phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒包含了灵敏高效实现滚环扩增（RCA）所需的全部试剂，这是一种等温扩增方法，通过产生环状序列的长重复拷贝来连续扩增环状 DNA。该试剂盒的特点是包含 phi29-XT DNA 聚合酶，该酶是经基因工程改造过的聚合酶，相较于野生型 phi29 DNA 聚合酶，可在更短反应时间内获得高产量的产物，并改善热稳定性和灵敏度。该试剂盒还包含 dNTPs 和外切酶抗性的随机引物（含有硫代磷酸酯键），确保了扩增环状 DNA 序列的通用性。起始材料可以是纯化的环状 DNA（单链或双链），或者直接使用液体培养基培养物、琼脂平板菌落和甘油菌，而不需要额外进行 DNA 提取。RCA 产物可直接用于下游应用，如 DNA 测序、无细胞 DNA 富集、无细胞蛋白表达和 DNA 生物传感器。

phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒（NEB #E1603）是一种快速、使用简单、用途广泛的试剂盒，该试剂盒中包含使用随机引物混合物进行滚环扩增（RCA）所需的全部试剂。该试剂盒可从纯化的环状 DNA 或细菌细胞等多种起始样本获得高得率的 DNA 产物。该试剂盒应用广泛，可用于 DNA 测序、无细胞 DNA 富集、无细胞蛋白表达和 DNA 生物传感器。

 

产品描述：

升温下，相较于野生型 phi29 DNA 聚合酶，phi29-XT DNA 聚合酶在更短的时间内能获得更多的产物

使用 Quant-iT® PicoGreen® dsDNA 试剂测定反应产量（点），并求得平均值（线）以确定各个反应温度下的产量。野生型 phi29 DNA 聚合酶的反应温度在 30°C 和 37°C之间，然而 phi29-XT DNA 聚合酶在 42°C能获得更多的产物。以 0.1 pg pUC19 质粒（NEB #N3041）作为起始样本，在指定温度下进行 RCA 反应 2 小时，随后在 65°C下加热失活 10 分钟，平行重复反应三次。所有反应均含有 1 mM dNTPs 和 50 µM 外切酶抗性随机引物。野生型 phi29 反应使用 10 个单位 phi29 DNA 聚合酶（NEB#M0269）、1X phi29 DNA 聚合酶反应缓冲液和 0.1 mg/mL 重组白蛋白，phi29-XT 反应使用 1X phi29-XT DNA 聚合酶和 1X phi29-XT 反应缓冲液。

 

 

即便 pUC19 DNA 起始量低至 1 fg，phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒也可实现高效扩增

在没有模板（NTC）或使用 1 fg pUC19 质粒的条件下，使用 phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒（NEB #E1603）在 42°C下进行 2 小时的 RCA 反应，平行重复反应四次。使用 AclI（NEB #R0598）消化反应产物，该酶特异性切割质粒序列以产生两个片段（373 bp 和 2,313 bp），并使用琼脂糖凝胶电泳验证扩增成功性。phi29-XT DNA 聚合酶可在 2 小时内高效扩增 1 fg 的 2.7 kb 环状质粒 DNA

 

phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒能显著提高产量和灵敏度

使用市售的 phi29 DNA 聚合酶，根据操作说明，以 1 pg 或 1 ng pUC19 质粒作为起始样本，进行 RCA 反应 2 小时，平行重复反应三次。使用 Quant-iT® PicoGreen® dsDNA 试剂测定反应产量（点），并求得平均值（柱）。相较于其它市售产品，phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒（NEB#E1603）在更短的时间内能获得更多的产量。

 

 

与传统的质粒制备方法相比，使用 phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒进行菌落直扩时，能在更短的时间内实现无细胞蛋白表达

A.挑选携带 pET28a 载体的单个菌落，该载体用于表达含有 T7 启动子的 eGFP，挑选的单菌落用水进行稀释。随后使用 phi29-XT RCA（滚环扩增）试剂盒（NEB #E1603）制备质粒或使用传统液体培养法抽提质粒。

B.对 RCA 产物（1 µl 20 倍稀释的 RCA 产物）或使用传统液体培养法抽提到的质粒（900 ng）进行 Sanger 测序，结果如图所示。

C.序列验证后，使用 NEBExpress® 无细胞 E. coli 蛋白合成系统（NEB #E5360）表达 GFP 蛋白。在 10 µl 总反应体系中，使用 2.4 µl 20 倍稀释的 RCA 反应产物或 100 ng 纯化质粒作为模板。通过 eGFP 荧光评估蛋白合成效率，相较于抽提的质粒，RCA 产物能够在更短时间内更高效地实现 GFP 无细胞体外蛋白合成。