重组蛋白纯化系统Target tag/PA tag生物试剂-Wako富士胶片和光
重组蛋白纯化系统Target tag/PA tag
重组蛋白纯化系统Target tag/PA tag
◆TARGET 标签系统 标签序列【(YPGQ)5V】
● 通过树脂再生，降低运作成本
● 温和洗脱、清洗，实现高纯度
● 在动物细胞表达系（HEK293T细胞、CHO细胞等）中有效纯化蛋白
TARGER标签系统使用的是可识别肽标签（21个氨基酸残基）的单抗（P20.1），是日本开发的亲和纯化标签系统。
TARGET标签系统实践证明，即使在传统系统都难以进行高纯度蛋白纯化的动物细胞表达系中，也可有效地进行亲和纯化。
TARGET标签系统
A rapid screening method for cell lines producing singly-tagged recombinant proteins using the“ TARGET tag”system. Tabata S. et al., J. Proteomics, 2010 Aug 5;73(9):1777-85.
TARGET 标签表达载体示意图
产品选择
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载体
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表达模式
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宿主细胞
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MCS启动子
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pEBMulti
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非整合型稳定表达
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灵长类（人、猴）、狗细胞等贴壁细胞
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CAG
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pCAG
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瞬时表达
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灵长类（人、猴）、狗细胞等贴壁细胞、大/小鼠等动物细胞
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CAG
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和光还推出除上述抗性基因载体外的其他载体。（请点击查看）
测序用引物序列、其他载体序列的相关详细信息，已附在产品随货说明书中。
另外可点击和光主页/TARGET标签，查看序列信息、多克隆位点(MCS)信息。
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TARGET标签融合蛋白的免疫沉淀
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通过Transient 载体，
表达TARGET标签融合重组蛋白
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培养上清（培养第7天）
每10 mL中，分别添加0.1 mL（net 0.05 mL）的抗体磁珠（①抗TARGET标签抗体琼脂糖珠、②抗DYKDDDDK标签抗体琼脂糖珠，其他公司产品），4℃条件下，进行2小时免疫沉淀。
清洗后，在回收的各珠中分别添加0.5 mL 0.2 mg/mL
TARGET标签肽/TBS和0.2 mg/mL DYKDDDDK肽/TBS，4℃条件下，平稳震动0.5小时。离心后回收上清。
再分别在各珠中添加0.5 mL 0.1 M Glycine-HCl (pH 2.7)，室温下，平稳震动5分钟。离心后，回收上清并用1M Tris-HCl (pH 9.0)中和。
上图为SDS-PAGE处理后的银染结果。
与传统DYKDDDDK tag相比，背景更低
→高纯度！
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M：M.W. Marker
1.仅转染载体的培养上清
2.转染了蛋白Y-TARGET 标签表达质粒的细胞培养上清
3.转染了TARGET标签-蛋白Y 表达质粒的细胞培养上清
也可使用市售的Transient载体
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确认非整合型载体TARGET tag C端融合重组蛋白的表达
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利用可编码表达人源生理活性蛋白基因的质粒转染HEK293N细胞后，从初期细胞数3×10^5cells/mL开始培养，回收0/3/7日的培养上清。
用20μL/lane的培养上清进行SDS-PAGE处理，通过银染和Western blotting，检测出蛋白的表达。
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可确认到与市面售卖的Tag系统有相同的表达量和检测灵敏度。
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TARGET 标签系列
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产品名称
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子类
克隆号
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适用
实验
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规格
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产品编号
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包装
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单抗
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抗TARGET标签, 单抗
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小鼠IgG1
P20.1
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IP, WB
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免疫化学用
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016-25481
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200 μg
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012-25483
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1 mg
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HRP标签单抗
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抗TARGET tag, 单抗,
过氧化酶结合
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小鼠IgG1 P20.1
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WB
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免疫化学用
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015-25571
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200 μL
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011-25573
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1 mL
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产品名称
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子类克隆号
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规格
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产品编号
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包装
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抗体结合琼脂糖珠
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抗TARGET标签抗体琼脂糖珠
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小鼠IgG1
P20.1
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免疫化学用 |
018-25561 |
2 mL
(Net 1 mL)
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| 014-25563 |
10 mL
(Net 5 mL)
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| 012-25564 |
50 mL
(Net 25 mL)
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识别N端、C端的TARGET标签
使用载体：4%琼脂糖
溶液组成：1×TBS (pH 7.5), 0.05 w/v%叠.氮化钠
抗体结合量：2.0 mg/mL
结合容量：1 mL本品可结合约0.1-1.0 mg的TARGET标签融合蛋白
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产品名称
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备注
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规格
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产品编号
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包装
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肽
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TARGET标签肽
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含量（HPLC）95%以上
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基因研究用
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200-19673
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5 mg
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208-19674
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25 mg
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清洗液
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TARGET标签清洗液
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已过滤消毒
即用型
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基因研究用
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208-19831
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50 mL
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产品名称
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可选Marker
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产品编号
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包装
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大肠杆菌
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动物细胞
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瞬时表达载体
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C端插入TARGET标签的pCAG-Ble载体
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博莱霉素
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165-26381
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20 μg
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N端插入TARGET标签的pCAG-Ble载体
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博莱霉素
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162-26391
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20 μg
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C端插入TARGET标签的pCAG-Bsd载体
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杀稻瘟素S
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165-26401
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20 μg
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N端插入TARGET标签的pCAG-Bsd载体
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杀稻瘟素S
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162-26411
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20 μg
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C端插入TARGET标签的pCAG-Hyg载体
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潮霉素B
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169-26421
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20 μg
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N端插入TARGET标签的pCAG-Hyg载体
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潮霉素B
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166-26431
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20 μg
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C端插入TARGET标签的pCAG-Neo载体
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卡那霉素
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G418
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163-26441
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20 μg
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N端插入TARGET标签的pCAG-Neo载体
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卡那霉素
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G418
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160-26451
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20 μg
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游离载体
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C段插入TARGET标签的pEBMulti-Ble载体
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博来霉素
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167-26461
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20 μg
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N段插入TARGET标签的pEBMulti-Ble载体
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博来霉素
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164-26471
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20 μg
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C段插入TARGET标签的pEBMulti-Bsd载体
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杀稻瘟素S
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161-26481
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20 μg
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N段插入TARGET标签的pEBMultI-Bsd载体
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杀稻瘟素S
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168-26491
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20 μg
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C段插入TARGET标签的pEBMulti-Hyg载体
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潮霉素B
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161-26501
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20 μg
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N段插入TARGET标签的pEBMulti-Hyg载体
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潮霉素B
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168-26511
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20 μg
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C段插入TARGET标签的pEBMulti-Neo载体
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卡那霉素
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G418
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165-26521
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20 μg
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N段插入TARGET标签的pEBMulti-Neo载体
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卡那霉素
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G418
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162-26531
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20 μg
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C段插入TARGET标签的pEBMulti-Puro载体
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氨苄青霉素
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嘌呤霉素
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169-26541
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20 μg
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N段插入TARGET标签的pEBMulti-Puro载体
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氨苄青霉素
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嘌呤霉素
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166-26551
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20 μg
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◆PA标签系统 标签序列【GVAMPGAEDDVV】
● 通过树脂再生，降低运行成本
● 超高亲和性抗体，实现高回收率、高纯度纯化
● 在动物细胞表达系（HEK293T细胞、CHO细胞等）中，有效纯化蛋白
● PA标签系统是使用可识别肽标签（12个氨基酸残基）的单抗（NZ-1）。日本开发的亲和性纯化标签系统。
● NZ-1单抗对PA tag具有高亲和性和特异性，可应用于Western Blotting、细胞流式分析、免疫组化（ICC）。
通过免疫沉淀，可纯化PA标签融合蛋白以及树脂再生。
● PA标签系统，可一步纯化高纯度PA标签融合蛋白。
PA标签系统
Fujii, Y. et al., “PA tag: A versatile protein tagging system using a super high affi nity antibody against a dodecapeptide derived from human podoplanin.”, Protein Exp. Purif., 95, 240-247(2014).
Fujii, Y. et al.
新型亲和标签系统“PA tag”的应用方法~蛋白的纯化及检测~
蛋白科学学会档案, 7, e075 (2014)
PA标签表达载体案例
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载体
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表达模式
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宿主细胞
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MCS启动子
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pCAG
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瞬时表达
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灵长类（人、猴）、犬细胞等粘着细胞
和啮齿动物细胞
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CAG
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和光还推出除上述抗性基因载体外的其他载体。（请点击参考。）
测序用引物序列、其他载体序列的相关详细信息，已附在产品现货说明书中。
另外可点击和光主页/TARGET标签，查看序列信息、Multi Cloning Site(MCS)信息。
用PA标签从培养上清中亲和提纯的案例
数据提供：大阪大学 蛋白研究所附属蛋白分析先进研究中心
分子创制学研究室 高木淳一老师，藤井勇树老师
Protocol 目的蛋白的纯化
１．哺乳类动物细胞转染(HEK293T)
转染处于40-60%融合状态的细胞
培养基：D-MEM, 5%FBS
２．回收培养上清和吸附蛋白树脂
转染48-72小时后，回收约420 mL培养上清，加入8 mL抗PA标签抗体琼脂糖珠，混合2小时（2-10℃）
３．树脂回收
用50 mL的纯化柱。回收步骤2)中的琼脂糖珠
４．树脂洗涤
加入珠4倍量的TBS 缓冲液（20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl），清洗5次
５．PA标签肽从树脂中竞争性洗脱
加入经1×TBS溶液, pH 7.5溶解过的PA 标签肽（终浓度0.1 mg/mL），体积量需为珠的一倍，
然后分10次回收PA标签融合蛋白X
６．SDS-PAGE
样品量
c. sup：5 μL, flow through：5 μL, wash：5 μL,
肽洗脱（1-10）：各10 μL
可纯化PA标签融合蛋白X且不依赖PA标签。→可实现*纯度的亲和纯化。
通过PA tag降低背景的方法
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可在含有高浓度NaCl的TBS溶液中，通过前清洗去除杂质蛋白！！
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M: Marker
I: input 100ng分
P: 纯化前样品
1: wash片段①
2: wash片段②
3: wash片段③
4: wash片段④
5: wash片段⑤
6: wash片段⑥
7: wash片段⑦
8: wash片段⑧
9: wash片段⑨
10: 酸洗脱①
11: 酸洗脱②
12: 酸洗脱③
13: 酸洗脱④
14: 酸洗脱⑤
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在20 mL的昆虫细胞溶解液中加入蛋白Z，使其浓度变为1.0 mg/L后，添加200 μL抗PA标签抗体琼脂糖珠，4℃温度条件下，搅拌3小时。
分别用不同浓度的TBS溶液（0.15 M、0.5 M、1.0 M NaCl）进行调整，用琼脂糖珠50倍量清洗。在回收的各珠中加入0.5 mL 0.1 M Glycine-HCl(pH 2.7)，室温条件下平稳震动5 min。
离心后回收上清，用1 M Tris-HCl (pH 9.0)做中和处理。
SDS-PAGE后进行银染，比较去除污染蛋白之后，不同浓度下的结果。
使用案例：Western Blotting
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数据提供：东北大学研究生院医学系研究科
地域革新领域 加藤 幸成老师，金子 美华老师
NZ-1显示出与天然抗体具有相同的高检测灵敏度。
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Lane 1
一抗：抗IDH1抗体（RcMab-1）, 1 μg/mL
二抗：抗大鼠IgG-HRP标签, 1000倍稀释
Lane 2
一抗：抗PA tag抗体, 1 μg/mL
二抗：抗大鼠IgG-HRP标签, 1000倍稀释
Lane 3
一抗：抗DYKDDDDK标签抗体, 3.5 μg/mL
二次抗体：抗小鼠IgG-HRP标签, 1000倍稀释
样品量：各10 μg
曝光时间：10分钟
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PA标签系列
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产品名称
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子类克隆号
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适用实验
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规格
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产品编号
|
包装
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单抗
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抗PA标签, 大鼠单抗
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大鼠IgG2a
NZ-1
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IP, WB, FCM, ICC
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免疫化学用
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016-25861
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200 μL
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012-25863
|
1 mL
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HRP标签单抗
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抗PA标签, 大鼠单抗,过氧化酶结合
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大鼠IgG2a
NZ-1
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WB
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免疫化学用
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015-25951
|
200 μL
|
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011-25953
|
1 mL
|
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产品名称
|
子类克隆号
|
规格
|
产品编号
|
包装
|
|
抗体结合琼脂糖珠
|
|
抗PA标签抗体琼脂糖珠
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大鼠IgG2a NZ-1
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免疫化学用
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012-25841
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2 mL(Net 1 mL)
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018-25843
|
10 mL
(Net 5 mL)
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016-25844
|
50 mL
(Net 25 mL)
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识别N端、C端的PA标签
使用载体：4% 琼脂糖
溶液组成：1 x PBS (pH7.2), 0.05 w/v%叠.氮化钠
抗体结合量：参见标签记载
结合容量：1 mL本品可结合约0.015-1.0 mg的PA标签融合蛋白
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抗体结合磁珠
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MagCaptureTM HP 抗PA标签抗体磁珠
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大鼠IgG2a NZ-1
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免疫化学用
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137-18751
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2 mL
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溶液组成：1×TBS(pH 7.4), 50% glycerol, 0.05 w/v% sodium azide
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产品名称
|
备注
|
规格
|
产品编号
|
包装
|
|
肽
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|
PA标签肽
|
含量（HPLC）95%以上
|
基因研究用
|
167-25501
|
5 mg
|
|
163-25503
|
25 mg
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|
清洗溶液
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|
PA标签清洗溶液
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已过滤消毒
即用型
|
基因研究用
|
169-27261
|
50 mL
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产品名称
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可选Marker
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产品编号
|
包装
|
|
大肠杆菌
|
动物细胞
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瞬时载体
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pCAG-Ble PA 标签-C
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Bleomycin
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161-26861
|
20 μg
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pCAG-Ble PA 标签-N 信号 增加型
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Bleomycin
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168-26871
|
20 μg
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pCAG-Bsd PA 标签-C
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Blasticidin S
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165-26881
|
20 μg
|
|
pCAG-Bsd PA 标签-N 信号 增加型
|
Blasticidin S
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162-26891
|
20 μg
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pCAG-Neo PA 标签-C
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Hygromycin B
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165-26901
|
20 μg
|
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pCAG-Hyg PA 标签-N 信号 增加型
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Hygromycin B
|
162-26911
|
20 μg
|
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pCAG-Neo PA 标签-C
|
Kanamycin
|
G418
|
169-26921
|
20 μg
|
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pCAG-Neo PA 标签-N 信号 增加型
|
Kanamycin
|
G418
|
166-26931
|
20 μg
|
