MTT法检测细胞活性步骤及原理
要知道MTT法检测细胞活性步骤首先要知道MTT是什么？MTTMTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。
MTT法检测细胞活性原理
检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
MTT法检测细胞活性步骤
A.Hela细胞复苏
1.从液氮容器中取出从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；
2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上DEME培养液，混匀；
3.离心，1000rpm，5min；
4.弃去上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度至1×104个/mL，部分接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5.次日更换一次培养液，继续培养，此后定期更换培养液，维持细胞正常活性。
B.MTT检测复苏细胞的细胞活性
Hela细胞计数用血细胞计数板的四个角上的方块。
1.接种培养瓶同时，将其余部分接种于96孔细胞培养板，7组，每组5孔，每孔100μL,37℃培养箱静置培养；
2.培养24h后，向每孔内加入用磷酸缓冲液配制的0.5%MTT（5mg/mL）20uL，37℃培养箱内培育；
3.4h后终止培养，将孔内培养液小心吸出。每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。同时每行第一孔设置为调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）。用酶标仪OD570nm处测量各孔吸光值；
C.细胞生长曲线制作
接B.2，B.3步骤，连续测量7天，根据测量结果绘制细胞生长曲线。
[横坐标生长时间，纵坐标吸光度值。]
D.探究某药物对于细胞活性的影响
1.将之前培养于培养瓶中的细胞用0.5%胰蛋白酶洗脱，加入DEME培养液制成细胞密度为1×106个/mL的细胞悬液；
2.设置空白对照组及5个不同药物梯度的实验组，分别加载96孔培养板内（5个梯度剂量按药物种类待定），每个剂量分别设置5个平行孔，每孔加入细胞悬液100μL（在加药的前一天下午完成铺板）；
3.次日上午按预先设置的药物梯度加药，后置37℃培养箱培养24h；
4.每孔加入20μLMTT溶液，继续培养4h（若药物能与MTT反应，可以先离心后弃去上清液，用PBS冲洗2-3遍后再加入MTT溶液）
5终止培养，小心吸去孔内培养液；
6.每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，用酶标仪OD490nm处测量各孔的吸光度；
7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
E.Hela细胞冻存?
1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2.取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接细胞移至15ml离心管中；
3.离心1000rpm，5min；
4.去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
5.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5?ml；
6.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
7.冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/?min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10
℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h?，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
MTT法检测细胞活性原理
检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
MTT法检测细胞活性步骤
A.Hela细胞复苏
1.从液氮容器中取出从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；
2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上DEME培养液，混匀；
3.离心，1000rpm，5min；
4.弃去上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度至1×104个/mL，部分接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5.次日更换一次培养液，继续培养，此后定期更换培养液，维持细胞正常活性。
B.MTT检测复苏细胞的细胞活性
Hela细胞计数用血细胞计数板的四个角上的方块。
1.接种培养瓶同时，将其余部分接种于96孔细胞培养板，7组，每组5孔，每孔100μL,37℃培养箱静置培养；
2.培养24h后，向每孔内加入用磷酸缓冲液配制的0.5%MTT（5mg/mL）20uL，37℃培养箱内培育；
3.4h后终止培养，将孔内培养液小心吸出。每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。同时每行第一孔设置为调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）。用酶标仪OD570nm处测量各孔吸光值；
C.细胞生长曲线制作
接B.2，B.3步骤，连续测量7天，根据测量结果绘制细胞生长曲线。
[横坐标生长时间，纵坐标吸光度值。]
D.探究某药物对于细胞活性的影响
1.将之前培养于培养瓶中的细胞用0.5%胰蛋白酶洗脱，加入DEME培养液制成细胞密度为1×106个/mL的细胞悬液；
2.设置空白对照组及5个不同药物梯度的实验组，分别加载96孔培养板内（5个梯度剂量按药物种类待定），每个剂量分别设置5个平行孔，每孔加入细胞悬液100μL（在加药的前一天下午完成铺板）；
3.次日上午按预先设置的药物梯度加药，后置37℃培养箱培养24h；
4.每孔加入20μLMTT溶液，继续培养4h（若药物能与MTT反应，可以先离心后弃去上清液，用PBS冲洗2-3遍后再加入MTT溶液）
5终止培养，小心吸去孔内培养液；
6.每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，用酶标仪OD490nm处测量各孔的吸光度；
7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
E.Hela细胞冻存?
1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2.取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接细胞移至15ml离心管中；
3.离心1000rpm，5min；
4.去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
5.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5?ml；
6.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
7.冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/?min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10
℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h?，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
MTT法检测细胞活性其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氧酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。MTT法检测细胞活性该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
