·Faustovirus 病毒加帽酶（FCE）用于在 RNA 5′末端的三磷酸和二磷酸位置加 m7G-帽（Cap-0）

 Faustovirus 病毒加帽酶（FCE）在转录产物 5′末端的三磷酸和二磷酸位置催化加入 N⁷–甲基鸟苷帽（m7G），产生带有 Cap-0 帽的 RNA。FCE 是一种单亚基酶，具有给 RNA 加 Cap-0 帽所需的三种酶活：三磷酸酶，鸟嘌呤转移酶，（鸟嘌呤-N7）–甲基转移酶。真核生物 mRNA 成熟的关键步骤是：添加 Cap-0 帽结构、第一个核苷酸 2′-O-甲基化（Cap-1）和多聚腺苷化加尾（poly（A））。Cap-0 结构还增加了 RNA 的稳定性，避免三磷酸化的 RNA 激活天然免疫反应。

FCE 从低温至 55℃ 高温范围内，均能够维持加帽活性。一般情况下，1 µl FCE（25 units）可以在 37°C 条件 1 小时内完成＞100 µg RNA 的加帽。本产品提供加帽所需的 GTP 和 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。

来源：由大肠杆菌（E. coli）质粒表达 Faustovirus 病毒加帽酶（FCE）编码序列，C-端带有 His-tag。

图 1：FCE 提高加帽效率，优化操作流程

A. 分别使用 FCE 和牛痘病毒加帽系统（VCE）在 37℃ 条件下加帽。以含有不同 5´-UTR 序列（如图所示）的 FLuc 转录本（1.77 kb）作为加帽底物（200 μg，相当于约 350 pmol，浓度为 7 μM），分别使用 FCE（25 units 相当于 1 pmol，在 50 μl 体系中浓度为 20 nM）或 VCE（25 units 相当于 1 pmol，在 50 μl 体系中浓度为 20 nM）37℃ 孵育 1 小时。需要注意的是，上述条件低于我们推荐的酶用量，用以展示 FCE 比 VCE 的加帽效率更高，以及在流程优化上的优势。

B. 使用 FCE 分别在 37℃ 和 42℃ 条件下进行 mRNA 加帽。以含有不同 5´-UTR 序列（如图所示）的 FLuc 转录本（1.77 kb）作为加帽底物（200 μg，相当于约 350 pmol，浓度为 7 μM），使用 FCE（25 units 相当于 1 pmol，浓度为 20 nM）37℃ 孵育 1 小时。需要注意的是，上述条件低于我们推荐的酶用量，用以展示 FCE 在流程优化上的优势。加帽反应体系为 50 μl，含有 0.1 mM SAM、0.5 mM GTP、以及用于 FCE 反应的 1X FCE 加帽缓冲液或用于 VCE 反应的 1X 加帽缓冲液。反应结束后，进行靶向 RNase H 切割，并使用 LC-MS 检测 mRNA 加帽效率。

图 2：FCE 的 RNA 加帽反应适用于更宽泛的温度范围

分别使用 FCE 和 VCE 在 15℃-60℃ 条件下进行 RNA 加帽。20 μl 加帽反应体系中含有：2.5 μM RNA 底物（5´-三磷酸 20mer 3´-FAM）、8 nM 加帽酶、0.1 mM SAM 和 0.5 mM GTP。FCE 加帽反应在 1X FCE 加帽缓冲液中进行，VCE 加帽反应在 1X 加帽缓冲液中进行。所有反应在指定的反应温度下孵育 30 分钟。通过毛细管电泳检测反应产物。

图 3：FCE 可对各种 RNA 进行高效 5’加帽（50 units至少加帽 100 ug RNA）

上图展示了 FCE 对多种 mRNA 的加帽效果。以含有不同 5´-UTR 序列（如图所示）的 FLuc 转录本（共 1.77 kb）作为加帽底物（200 μg，相当于约 350 pmol，浓度为 3.5 uM），在含有 1X FCE 缓冲液的 100 μl 反应体系中加入 2 μl 的 FCE（50 units 相当于 2 pmol，浓度为 20 nM），37℃ 条件下孵育 1 小时。反应结束后，进行靶向 RNase H 切割，并使用 LC-MS 检测 mRNA 加帽效率。