Caspase 3/7 活性检测试剂盒(Caspase 3/7 Activity Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中caspase 3/7酶活性或纯化的caspase 3/7酶活性的试剂盒。
        Caspase (Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 3也称CPP32、Yama或apopain，有时被写作caspase-3或caspase 3，属于caspase家族的CED-3亚家族(CED-3 subfamily)，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。Caspase 3是哺乳动物细胞中研究最多的一个caspase。Caspase 3和Caspase 7都可以剪切DEVD肽段序列，因此本试剂盒可以检测caspase3/7。
        本试剂盒是基于Caspase 3/7可以催化底物Ac-DEVD-pNA产生黄色的pNA (p-nitroaniline)，从而可以通过测定吸光度来检测caspase 3/7的活性。pNA在405nm附近有强吸收。
        本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过100μl的分光光度检测杯检测时，除标准曲线外可以检测20个样品(20T)或者100个样品（100T）。

产品组分：

名称	20T	100T
裂解液（Lysis buffer）	8ml	30ml
检测缓冲液（Assay buffer）	8ml	20ml
Ac-DEVD-pNA(2mM)	200ul	1ml
pNA(10mM)	200ul	1ml

在使用PBS的过程中要特别注意避免溶液被微生物污染。PBS在低温情况下可能会产生沉淀。如果发现有沉淀产生，请置于37℃水浴至完全溶解后再使用。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1. 准备工作：
a. 裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
b. 检测缓冲液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
2. 测定pNA标准曲线：
a. 标准品稀释液的配制：按照每0.9ml检测缓冲液加入0.1ml裂解液的比例配制适量的标准品稀释液。
b. 把试剂盒提供的pNA (10mM)用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200μM，作为标准品。
c. 每个浓度取100μl用酶标仪进行检测，或取适当量用容量不超过100μl的分光光度检测杯进行检测，测定A405。
d. 每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405计算出实际的因pNA而导致的吸光度，并制作出pNA浓度相对于A405的标准曲线。
3. 样品的收集：
a. 对于悬浮细胞：把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品，600g 4ºC离心5分钟收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次。同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。下转步骤3d。
b. 对于贴壁细胞：吸取细胞培养液，备用。用胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。600g 4ºC离心5分钟收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次。同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。下转步骤3d。
c. 对于组织样品：按照每3-10mg组织加入100微升裂解液的比例加入裂解液，在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆。然后把匀浆液转移到1.5ml离心管中，冰浴再裂解5分钟。
d. 4ºC 16,000-20,000g离心10-15分钟。
e. 把上清转移到冰浴预冷的离心管中。
f. 立即测定caspase 3/7的酶活性或-80ºC保存样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度，尽量使蛋白浓度达到1-3mg/ml，相当于每10微升待测样品中至少含有10-30μg蛋白。如果细胞较少，可以适当增加细胞的用量。
4. Caspase 3/7酶活性的检测：
a. 取出适量的Ac-DEVD-pNA (2mM)，置于冰浴上备用。
b. 如下设置反应体系：

名称	空白对照	样品
检测缓冲液	40μl	40μl
待测样品	0μl	50μl
裂解液	50μl	0μl
Ac-DEVD-pNA (2mM)	10μl	10μl
总体积	100μl	100μl

注意：在设置反应体系时先加检测缓冲液，再加待测样品，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡。随后再加入10μl Ac-DEVD-pNA (2mM)。

c. 加入Ac-DEVD-pNA (2mM)后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37ºC孵育60-120分钟。发现颜色变化比较明显时即可测定A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。
d. 样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中caspase 3/7催化产生的pNA产生的吸光度。通过同步骤1中获得的标准曲线对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的pNA。
e. 参考Chemicon公司的caspase 3/7酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0nmol of the colorimetric substrate Ac-DEVD-pNA per hour at 37ºC under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37ºC一个小时内可以剪切1nmol Ac-DEVD-pNA产生1nmol pNA的caspase 3/7的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的caspase 3/7。说明：在本试剂盒的检测体系中，底物的起始浓度为0.2mM，此时底物是饱和的，对于许多样品而言在37ºC孵育2个小时以内底物都是饱和的；对于样品中caspase 3/7酶活力特别高的情况，须用裂解液适当稀释样品后再进行测定。
f. 用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度(由于裂解液中含有较高浓度的DTT，不适合采用BCA法进行蛋白浓度测定)。这样就可以计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 3/7的酶活力单位。

CPP32,Yama,apopain,caspase-3,caspase 3

-20℃保存，Ac-DEVD-pNA和pNA需要避光保存。有效期12个月。