小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的培养

DC 是“Dendritic Cells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC 是由2011 年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家Ralph M. Steinman 于1973 年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已证实，DC 是唯一能够显著刺激初始T 细胞(Naïve T cells)增殖的APC，而其它种类的APC(如单核巨噬细胞，B 细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T 细胞，因此DC 是机体适应性T 细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中发挥着极其重要的作用。

  虽然DC 存在于体内多种组织中，但含量很少，无法满足科学研究和临床治疗的需要，所以人们尝试多种方法来体外培养和扩增DC。对于人，最常用的方法是从人外周血单个核细胞(PBMC)诱导DC 的产生。而对于小鼠，最常见的方法是从骨髓细胞诱导产生DC，即骨髓来源的DC(Bone Marrow-Derived Dendritic Cells，BMDC)。

【步骤简图】

本文主要介绍：

【经典的BMDC 培养法】-Inaba 法(改良) 
【BMDC大量制备法】-Son 法
【BMDC 大量制备法】-Lutz 法
【注意事项】

【经典的BMDC 培养法】-Inaba 法(改良) 

背景：

1. Inaba 法获得的BMDC 数目为5-7 x 106 个/小鼠；
2. Inaba 原法操作比较复杂，需要将骨髓中的淋巴细胞等用抗体+补体法预先去除，后来的改良法均省却了这个步骤，其实Inaba 后来自己也说这个步骤虽然可提高BMDC 的纯度，但不会对BMDC 的生成产生影响，可做可不做[10]；

3. Inaba 原法仅用GM-CSF 来诱导BMDC 的产生，虽然得到的BMDC 在混合淋巴细胞反应中有较强的刺激能力，但DC 的成熟度不及GM+IL-4 的联合诱导，所以后来的改良法中多用GM+IL-4 联合诱导。

培养步骤：

1. 小鼠骨髓细胞的获得
1.1 小鼠(6 – 10 周龄)颈椎脱臼法处死，手术取出所有股骨(femurs)和胫骨(tibias)，并剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净；
注：不要损伤到骨。
1.2 将骨移至超净台内，并用盛有70%酒精的无菌培养皿浸泡2-5min，以消毒灭菌，然后用无菌的PBS 洗2 次；
1.3 将骨移入另一个盛有PBS 的新培养皿中，用剪刀剪去骨两端，再用注射器抽取PBS，针头分别从骨两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓至培养皿中，直至
骨完全变白；
1.4 收集骨髓悬液，用200 目尼龙网滤去小碎片和肌肉组织；
1.5 滤过液1200 rpm 离心5min，弃上清；
1.6 加入2 ml 氯化铵红细胞裂解液(1x)，重悬细胞，室温孵育3-5min，最长10min；

氯化铵红细胞裂解液的配制：
1. 先配制10x的贮存液，配法如下：
称取82.9g NH4Cl，10.0gKHCO3和0.37g Na2EDTA，溶于1L的蒸馏水中，0.22μm滤膜过滤除菌，4oC储存6个月；
注：可根据需要配制适量的10x贮存液，其中各组分需成比例增减。
2. 临用前，将10x贮存液用无菌蒸馏水1 : 9稀释成1x工作液即可。 注：因氯化铵红细胞裂解液对骨髓细胞有一定的伤害作用，所以要尽量缩短溶血时间。
1.7 加入10 ml PBS 中和裂解液的作用，然后1200 rpm 离心5min，弃上清;
1.8 PBS 洗1 次，然后用含10% FBS 的RPMI 1640 培养液重悬细胞，至此已获得小鼠骨髓细胞。
2. BMDC 的诱导分化

2.1 步骤1 中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含10% FBS 的RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为0.5-1 x 106/ml；
2.2 铺至24 孔培养板内，每孔1ml 细胞，同时加入重组小鼠GM-CSF (20ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)，37℃，5% CO2 培养箱培养，此为培养的第0 天；
注：1) 一般一只小鼠大约可收获4-5 x 107个骨髓细胞，所以可以铺至少40-50个24 孔板板孔。
        2) GM-CSF 和IL-4 的使用浓度区间分别为20-50ng/ml 和10-40ng/ml。
2.3 每2 天轻轻摇晃培养板，然后3/4 体积更换新鲜培养液，并补足细胞因子。
2.4 在第5 天和第8 天之间，轻柔吹打培养液，收集悬浮细胞及巯松贴壁生长的细胞；
2.5 1200 rpm 离心5min，弃上清；
2.6 用含10% FBS 的RPMI 1640 完全培养液重悬细胞并计数，然后调整细胞浓度至1 x 106/ml，并加入重组小鼠GM-CSF (20 ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)；
2.7 细胞铺板至100 mm 培养皿(每皿最多10ml)或6 孔培养板(2m/孔)。
2.8 37℃，5% CO2 培养箱继续培养1-2 天；
2.9 收集悬浮细胞，即为较成熟的BMDC。

3. BMDC 的完全成熟
注：步骤2 中获得的BMDC 并非完全成熟的DC，若想得到完成成熟的DC，还需LPS，CD40L 或TNF-a 等的诱导。
3.1 步骤2.4 或2.9 中获得的BMDC 以1200rpm 离心5min，弃上清；
3.2 用含重组小鼠GM-CSF (20 ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)的RPMI 完全培养液重悬沉淀，计数后调整细胞浓度为1 x 106/ml；
3.3 加入24 孔培养板中，并加入成熟诱导剂，如TNF-α (250U/ml)，LPS (1μg/ml)、或CD40L(1μg/ml)等；
3.4 37℃，5% CO2 培养箱培养2 天；
3.5 收集悬浮细胞及疏松贴壁生长的细胞即为成熟树突状细胞。

【BMDC 大量制备法】-Son 法

背景：

1. 该法可在7 天内获得30-40 x 106 个DC/小鼠，是Inaba 经典方法的7-10 倍。DC经14.5%甲泛葡胺(Metrizamide)梯度离心后，纯度(即CD11c+/I-Ab+细胞)可达85-95%。
2. 该法获得的DC 的内吞能力弱于Inaba 经典方法，但分泌的IL-12p70 量相似；
3. 该法获得的DC 在混合淋巴细胞反应中比Inaba 经典方法呈现更强的刺激能力；
4. 该法获得的DC 能引起更强的特异性T 细胞反应；
5. 以上结果提示，该法比经典方法能获得更多、更成熟的BMDC。

培养步骤：

1. 小鼠骨髓细胞的获得
见Inaba 法(改良)中的相应步骤。

2. BMDC 的大量制备
2.1 步骤1 中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含10% FBS 的RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为2 x 105/ml；
2.2 铺至6 孔培养板内，每孔5ml 细胞，同时加入重组小鼠GM-CSF (1000U/ml)和IL-4 (1000U/ml)，37℃，5% CO2 培养箱培养；
2.3 在培养的第4 天，向培养体系中补充重组小鼠GM-CSF (1000U/ml)和IL-4(1000U/ml)；
2.4 培养的第7 天收集DC，用2-4ml RPMI 1640 完全培养液重悬，加至等体积的14.5%(w/v) 甲泛葡胺上，1200 x g 室温离心20min；
注：此时的DC 为不完全成熟的BMDC，要想进一步成熟，请跳至步骤3。
2.5 收集中间层，并用RPMI 1640 完全培养液洗3 次备用。
3. BMDC 的完全成熟
3.1 步骤 2.4 中收集的BMDC，重新铺板，并向培养体系中加入重组小鼠GM-CSF(1000U/ml)和IL-4 (1000U/ml)，以及LPS (1-10μg/ml)
3.2 37℃，5% CO2 培养箱培养2 天，获得成熟的BMDC。

【BMDC 大量制备法】-Lutz 法

背景：

1. Lutz 法与Son 法相似，均可大量制备BMDC，但与Son 法相比，Lutz 法更为广泛地被采用。
2. 该法可获得更多的BMDC，达1-3 x 108 个/小鼠，而且纯度可达90-95%；
3. 该法比Son 法使用的细胞因子浓度低得多，仅为200U/ml，而且培养的第8 天到第10 天降为30-100U/ml，这样可以大幅节约试剂成本；
4. 该法与Inaba 经典方法和Son 法的最大不同是使用细菌培养皿(Petri dish)而非细胞培养板来培养骨髓细胞。Inaba 的解释是细菌培养皿不容易使骨髓中的巨噬细胞贴壁，从而抑制巨噬细胞的发育，进而避免巨噬细胞对DC 成熟的抑制作用，这可能是该法能够以较低铺板密度获得大量BMDC 的主要原因。
5. 但该法的培养时间较长，需要10-12 天，一方面是为了获得更多的BMDC，另一方面，大多数粒细胞和淋巴细胞很难存活这么长时间，因此可提高最终获得的BMDC 的纯度；
6. 该法仅用GM-CSF 进行诱导培养，得到的BMDC 中未成熟和成熟DC 均有，若要进一步提高成熟度，需用LPS 或TNF-α再诱导1-2 天，其中成熟DC 细胞的含量将达到50-70%。

培养步骤：

1. 小鼠骨髓细胞的获得
见Inaba 法(改良)中的相应步骤，注意省去溶血步骤。

2. BMDC 的大量制备
2.1 步骤1 中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含10% FBS 的RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为2 x 105/ml；
2.2 铺至100mm 细菌培养皿(Petri Dish)中，每皿10ml 细胞，同时加入重组小鼠GM-CSF (200U/ml，对于PeproTech 的GM-CSF，相当于20ng/ml)，37℃，5%CO2 培养箱培养；
注：此处使用的是细菌培养皿，而非细胞培养板。
2.3 第3 天时，向培养皿中再加入10ml 含20ng/ml 重组小鼠GM-CSF 的完全培养液；
2.4 第6 天和第8 天分别半量换液，即收集旧培养液，离心后用含20ng/ml 重组小鼠GM-CSF 的完全培养液重悬细胞沉淀，然后再将细胞悬液放回原皿；
2.5 第10 天时可收集细胞，即为BMDC。

3. BMDC 的完全成熟
3.1 培养第10 天的DC 用移液器轻轻吹打收集悬浮细胞，300 x g 室温离心5min；

3.2 弃上清，用10ml RPMI 1640 完全培养液重悬细胞沉淀，然后铺于100 mm 细胞培养板；

3.3 加入重组小鼠GM-CSF(100U/ml ， 相当于PeproTech 的10ng/ml) 和TNF-α (500U/ml)，或重组小鼠GM-CSF(100U/ml，相当于PeproTech 的10ng/ml)和LPS (1μg/ml)；
3.4 37℃，5% CO2 培养箱继续培养1-2 天。

【BMDC 的鉴定】

1. 形态学观察：BMDC 多数呈集落生长，细胞有多个树突样突起，成熟的BMDC 更加明显；
2. 细胞表型分析：流式细胞术检测DC 细胞表面CD11c，CD40，CD80，CD86，MHCII 类分子(I-A/I-E)等的表达，BMDC 高表达这些分子，完全成熟的BMDC 中这些分子的表达会进一步提高。
3. 混合淋巴细胞反应(MLR)：BMDC 具有较强的刺激能力，且成熟度越高，刺激能力越强。

【注意事项】

1. 小鼠品系和性别：
多数研究表明，所使用的小鼠品系与获得BMDC 的数量和成熟度关系不大，但也有研究表明C57BL/6 小鼠可能更好。
Lutz 表示从C57BL/10，DBA/2，C3H/J 和129 等小鼠品系均可获得足够数量和纯度的BMDC，但Lutz 在其实验中更倾向于使用C57BL/6，ICR 和BALB/c 小鼠，且发现C57BL/6 小鼠的BMDC 产量最高，而且ICR 小鼠和C57BL/6 小鼠的BMDC 对LPS的成熟诱导敏感度高于BALB/c 小鼠。
关于小鼠的性别，Inaba 认为雄性小鼠更好些，因为他们的骨骼更大，从而可以获得更多的前体细胞，但多数学者更倾向于使用雌性小鼠。因此，目前培养BMDC 用的比较多的小鼠是雌性或雄性C57BL/6 小鼠。

2. 单独使用GM-CSF 还是联合使用IL-4?
Inaba 经典法和Lutz 大量制备法中均仅用GM-CSF 即可诱导出相当数量的BMDC，而且也在混合淋巴细胞反应中表现出较强的刺激作用，但其实这些BMDC 的成熟度并不足够高。
研究显示，GM-CSF+IL-4 联合诱导比GM-CSF 单独诱导产生的BMDC 表达更高的MHC II 类分子和共刺激分子CD80 和CD86 等，提示前者具有更强的抗原递呈能力，而且前者在混合淋巴细胞反应中表现出更有效的刺激能力。在动物实验中也发现，GM-CSF+IL-4 联合诱导的BMDC 可产生保护性抗肿瘤免疫反应，而GM-CSF 单独诱导的BMDC 的保护性较弱，这些都说明GM-CSF+IL-4 联合诱导的BMDC 的成熟度高于GM-CSF 单独诱导的BMDC。
德国明斯特大学(University of Munster)的Labeur 研究也表明，单独用GM-CSF 诱导的BMDC 为未成熟DC，GM-CSF 和IL-4 联合诱导产生的BMDC 的成熟度居中，添加CD40L 或LPS 可进一步诱导BMDC 完全成熟。

因此笔者认为，要想获得功能更好的BMDC，最好用GM-CSF 和IL-4 联合诱导骨髓细胞。而且，如果能在Inaba 经典法和Lutz 大量制备法中添加IL-4，应该会获得更加成熟、有效的BMDC。

3. 成熟诱导剂的选择

LPS，CD40L 和TNF-α无论对人DC 还是小鼠DC 均是常用、有效的成熟诱导剂，那么应该选择哪个呢？
TNF-a 诱导DC 的成熟能力在三者中最弱[7,8]。LPS 和CD40L 均是DC 体外完全成熟的强诱导剂，两者诱导DC 的成熟度相似，但诱导产生的细胞因子谱有差异。CD40L诱导成熟的BMDC 在体内显示出最强的免疫调节能力，包括保护性和治疗性肿瘤免疫反应的产生。
用LPS 刺激DC 完全成熟所用的浓度一般为1-10μg/ml，但其实0.1 μg/ml 已经有非常强的作用，但保险起见，一般选用1μg/ml。
对于CD40L 需要注意的是，CD40L 分子属于TNF 配体家族，该家族的特点是在形成三聚体后才能发挥作用。所以最好能用重组的CD40L 三聚体蛋白来刺激DC，这样会有很好的效果。如果用CD40L 单体来刺激DC，多数情况下成熟度并不是很高。

4. 培养方法的选择

【BMDC 相关试剂推荐】

注：用于DC 鉴定的表面标志物的表达在流式图上均呈现单个峰，且多数情况下不能与阴性峰完全区分开来。为避免多色分析时补偿调节不好导致结果的不准确性，建议最好用单标，最多用双标来做DC 表面标志的分析，而且必须使用同型对照，而非空白细胞对照来排除背景染色。

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