标签归档：问题解答

调节性T细胞( Tregs )常见问题解答

发表于由

调节性T细胞( Tregs )常见问题解答

1、天然Tregs和诱导性Tregs的区别是什么？

天然T细胞来源于胸腺CD4+细胞中高表达CD25并表达转录因子Foxp3的细胞，不受环境中细胞因子的影响(属于细胞因子非依赖型）。天然Tregs大约占CD4+细胞5-10% 可以在T淋巴细胞发育的单阳性阶段首先出现，并由于具有与自身抗原的高亲和力而被阳性选择。此信号传递是通过T细胞受体和胸腺基质细胞上的带有自身抗原肤的MHC 复合体相互作用完成。

另一方面，诱导性Tregs (iTregs) 来源于胸腺CD4单阳性细胞，当有足够的同源抗原刺激或者特异性免疫调节细胞因子如TGF-β，IL-10 and IL-4存在时，可以分化成CD25+，并表达FoxP3 的Tregs一 因此称为“适应性”或“诱导性”Tregs。 根据调节因子的不同，适应性或诱导性Tregs又被进一步分为Tr1，Tr2，或Tr3细胞。

2、小鼠和人CD4+Tregs有区别吗？

有的。在小鼠中，CD4+Tregs是一组同源性细胞群，所有的CD4+及CD25+细胞均为调节性T细胞。人类的Tregs是异质性细胞群，并不是所有的CD25+细胞都是Tregs。这一研究最早是由哈佛大学、the Royal Free and University College Medical School的科研人员通过对人CD4+CD25+细胞进行详细分析时观察到的。

研究结果显示，只有体外高表达CD25 (约占总CD4 T细胞2-3%) 的CD4+T细胞在体外才有抑制活性，这是相对与把表达CD25的细胞都当做Tregs的小鼠细胞而言，而且表达低到中等水平CD25的细胞在体外没有抑制活性。

3、Tregs在CD4+细胞中的比例是多少？ 此比例是否随着人年龄的增长而发生改变？

此数据也是4-9% (未经发表的内部统计数据)。然而即使在健康的捐赠者中，此数据也会有一定程度的改变。CD4+CD127loCD25+ Tregs的平均百分比在人的一生中只会发生轻微的增长（在人成年之后的20岁到25岁期间，其比例会从脐带血的6.10%增加到PBMCs的7.22%；到人类60岁时，PBMCs中的比例会达到7.5%）。研究显示，在健康的人及小鼠，CD4+/CD25+Tregs比值都会随着年龄的增加发生轻度增长。然而增长的Tregs数量与棉衣衰老质检确切的联系尚不明确

4、为什么把CD127作为人Tregs的标志至关重要？

来自Barbara Fazekas de St. Groth (Centenary Institute of Cancer Medicine and Cell Biotogy, Sydney, Australia) and Jeffrey Bluestone (UCSF Diabetes Center,San Francisco,CA)实验室的数据显示低表达CD127可以区别鉴定人Tregs。其低表达与FoxP3密切相关，并且显示CD127loCD25int/hi的CD4+T淋巴细胞就是Tregs。CD127low优于胞内表达的FoxP3的地方在于检测时不需要固定和破膜，细胞仍然存活，所以随后可用于培养或其他的体外实验。当用CD25的高表达判定Tregs时，研究人员可从正常的细胞群体中获得0.6%-7.9%的Tregs。而用CD127的低表达 (结合CD25) 作为新的圈门标准通常会得到单独用CD25high圈门而丢失的细胞。 此方法分选的CD25int/high Treg细胞比单独用CD25high圈门方式分选的Treg细胞的回收率增加了2-4倍，而且减少了CD25-/int效应细胞的污染。

5、哪些表面标志可分别用来鉴定人及小鼠CD4+T细胞？

目前推荐的判定人CD4 Tregs细胞的表面标志包括GITR，CTLA4 (细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白) ，CD39，CD62L，CDl27，CDl03以及结合CD45RA+表达的 LAG3(淋巴细胞活化基因 ) 。在小鼠中，FR4hiCD25+为n Tregs，FRloCD25+为效应T细胞，FR4hiCD25-为记忆T细胞，CD2S-CD4+为初始T细胞 。

6、什么是Foxp3？如何与CD4+T调节性T细胞相结合？

Foxp3 ((forkhead box P3) 是种胞内转录因子，是Tregs的特异性标志。在小鼠淋巴细胞增生性疾病的研究中被发现，而且在小鼠自发性基因突变“scurfy ”中可被检测到。在人类，由于FoxP3基因缺失可导致IPEX，所以Foxp3可有助于恶性自身免疫病IPEX (immunedysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked)的研究。

7、除了CD4细胞，是否还有其他类型的细胞也可表达Foxp3？

是的。有研究显示CD8细胞也可表达FoxP3，而且天然状态下也具有调节功能 。

8、人Foxp3是否存在多种异构体？BD Biosciences Foxp3 clone 259D/C7可识别哪种异构体？

有的。Foxp3有两种异构体：全长形式和缺乏外显子2的剪接变体。CD4+/CD25+细胞均可表达这两种异构体。

9、做抗人的Foxp3染色之前，样本可保存多久？

样本染色之前，-80℃保存人的PBMCs于人FoxP3缓冲液中24-72小时都是可行的。

10、小鼠Foxp3抗体可用于人Foxp3缓冲液吗？反过来是否可行？

不行。我们不建议互换人与小鼠的Foxp3缓冲液体系。要想得到小鼠或人FoxP3克隆最好的染色结果，我们建议参照不同克隆推荐的最适缓冲体系进行试验。

11、Foxp3染色是否可应用于人全血细胞样本？

可以。选择pBMCs作为高速细胞计数样本的首要原因，就是需要溶解/固定/破膜大量的全血以得到实验所需的足够的细胞数量。例如1ml全血含有大约1×10^6个淋巴细胞，而只有少于4-9%的CD4+细胞是Tregs。

12、如何检测Tregs功能？

Tregs可根据其对靶细胞功能的抑制能力进行检测，例如：

抑制靶细胞增殖或者

抑制靶细胞的细胞因子分泌

抑制标志物的活化

本文来源于网络，如需了解相关产品，请咨询上海金畔生物

Stressmarp试剂盒常见问题解答

发表于由

Stressmarp试剂盒常见问题解答

本篇为大家带来的是Stressmarp试剂盒常见问题解答，如大家想购买Stressmarp品牌的试剂盒产品，或咨询更多关于Stressmarp产品的问题，技术方面的支持，都可以联系Stressmarp代理商上海金畔生物。

1.该ELISA酶标板是用什么抗体包被的？

答：由于找到合适免疫测定的匹配抗体需要大量的时间和精力，所以我们不能提供制作试剂盒所用抗体的详细信息。

2.在样品孵育时加入预处理缓冲液的目的是什么？

答：某些ELISA试剂盒内的预处理液是为了将目标蛋白与其他可能的相关结合蛋白分离开。

3.怎样计算ELISA试剂盒的灵敏度？

答：ELISA 试剂盒灵敏度计算方法如下： {2(空白对照标准差) (空白对照以上的最低标准品浓度平均值)} / (空白对照以上最低标准品OD值的平均值—空白对照OD值的平均值). 需要10-20 个样品完成这个计算 。

4.怎样计算ELISA试剂盒的定量极限？

答：试剂盒的定量极限等于标准曲线中用的最低蛋白浓度。

5.不小心把其中一个试剂洒了，可以替换吗？

答：请与我们的技术支持团队联系 (1.250.294.9065 或 techsupport@stressmarq.com)。有的试剂盒中可能有另一个试剂可以作为替代品。如果没有，我们可以寄一个替代品给您 (费用需要您自己承担)。  

更多详情请咨询Stressmarp代理商 – 上海金畔生物

VectaPlex常见问题解答

发表于由

VectaPlex常见问题解答

VectaPlex常见问题解答


VectaPlex™ Antibody Removal Kit (VRK-1000)


Q: VectaPlex™可用于冰冻切片吗?

A: No. During development, VectaPlex™ was optimized for FFPE tissues, where the power to remove antibodies at room temperature was balanced with the need to preserve tissue morphology. For frozen tissues, VectaPlex™ will remove the tissue from the slide.


Q: VectaPlex™ 可以去除免疫组化 (IHC) 实验应用中的抗体染色（酶显色）吗？

A: VectaPlex™ Antibody Removal Kit is designed to be used in fluorescent workflows such as immunofluorescence or TSA. It has not been validated or confirmed for immunohistochemistry (IHC) applications. VectaPlex™ may remove substrates already deposited on tissue samples.


Q: 我有使用TrueView试剂盒去除组织的自发荧光, 请问TrueVIEW会被VectaPlex™试剂去除吗?

A: We used TrueView in our VectaPlex™ IF workflow to suppress autofluorescence. Application of VectaPlex™ removes some, but not all, of the TrueView reagent. Since some TrueView remained after VectaPlex™ application, we did not add TrueView in every cycle, but only as needed to suppress autofluorescence.


Q: 请问将VectaPlex™试剂盒放置到4℃冰箱一段时间，还可以使用吗?

A: Yes. VectaPlex™can withstand a freeze-thaw cycle and still perform as expected, but the recommended storage is at ambient temperature (15-25 °C). Additionally, the kit will still perform properly if placed at 4 °C.


Q: 在同一张切片上使用 VectaPlex™,是否有最大次数限制呢？

A: VectaPlex™ has been tested for up to 6 cycles with no ill effects. We don’t expect there to be issues with increasing the number of cycles, but we suggest testing with controls for adequate comparisons. We recommend running experiments to confirm that the use of more cycles does not impact the antigenicity or tissue morphology.


Q: VectaPlex™可用于自动化染色平台吗?

A: We have not tested this product on automated systems and cannot guarantee instrument compatibility at this time.


Q: VectaPlex™ 是否适用于所有种属来源的抗体?

A: VectaPlex™ has been tested with mouse and rabbit primaries, and with horse and goat secondaries. We expect it to work well with other species of antibodies as well. 


Q: VectaPlex™ 是否适用于不同类型的组织样本?

A: VectaPlex™ has been tested on and works well with various FFPE tissues, including FFPE breast and lung tissue which are very fragile.


Q: VectaPlex™ 是否与所有抗体相兼容?

A: VectaPlex™ has been tested on more than 30 common antibodies and has worked on them without issue.


Q: 在IF实验中, VectaPlex™ 抗体去除试剂是否也可以去除组织的自发荧光呢？

A: VectaPlex™ does not appear to reduce autofluorescence background.


Q: 是否可以提供使用VectaPlex™操作过程中移去盖玻片的操作流程呢?

A: We recommend using VectaShield® Plus Antifade Mounting Media with DAPI (H-2000), which is an aqueous non-hardening mounting medium. After each imaging cycle, the coverslip can be easily removed by incubating in PBS and the residual VectaShield® removed with a PBS wash.



详情请咨询 Vectorlabs代理商 -上海金畔生物科技 

Vector产品经理：15221999938 微信同号


StressMarq标记抗体常见问题解答

发表于由

StressMarq标记抗体常见问题解答

当您在使用StressMarq生产的标记抗体产品时，可能对产品或者是在实验时有遇到一些问题。本篇就是针对我们的标记抗体客户常见的一些问题解答，希望可以帮助到大家。如果里面列举的问题没有您所关注的，可以咨询我们的代理商上海金畔生物，协助您处理这些问题。

一、我怎么选择合适的荧光标记?

答：当选择荧光标记时，需要自问以下问题：

您显微镜上的滤光片/激光源是什么?

首先您需要知道您显微镜上的滤光片/激光源。他们将会决定您可以使用什么样的荧光蛋白或染料用来激发和显现。

您计划在一个样品上应用几个荧光素？

如果您在样品上使用一个以上的荧光素，那么您需要仔细挑选其他的荧光染料来最小化光谱重叠。您可以通过查看激发和发射光谱来决定使用哪一对染料，以降低他们的激发和发射光谱重叠。

如果您使用激光来激发荧光素，您只要确保您的激光 (ie. 488 nm) 不会同时激发两种以上的染料即可。如果该激光可触发到第二个荧光染料的激发光谱，那么在激发第一个染料时您可能会少量地激发到了第二个染料，而如果这时您的滤光片也能接受第二个染料的发射光，您就会得到不准确的信号。

然而如果您用来接收发射光谱的滤光片刚好不能接收到第二个染料发射的光，那么您拍得的图片就看不到这段重叠光谱，就没有问题。

二、抗体标记是怎么与抗体结合的？

答：标记与抗体是共价键结合的，非常稳定。

三、每个抗体可以结合几个标记？

答：根据被标记抗体和标记的不同，一个抗体可以结合1~10个标记。

四、抗体标记结合在抗体的什么位置？

答：抗体标记是结合在抗体游离的氨基基团上的。由于抗体Fc区域的游离氨基基团较多，所以标记通常是结合在抗体的Fc区域。然而标签很可能会与抗体决定簇结合从而使抗体与抗原的结合受阻。虽然这个可能性较低，但是还是会影响该抗体在某种应用中与抗原的结合能力。 • [indent]由于我们没办法控制标签与抗体的结合过程，所以我们不可能完全确定他们结合的位置。

五、标记抗体怎样保存？

答：所有保存在含50%甘油的缓冲液中的标记一抗都可以储存在-20℃。缓冲液中不含50%甘油的标记抗体应储存在4℃。

六、标记一抗稳定吗？

答：储存在4℃的标记一抗保质期18个月，-20℃保存的标记一抗保质期可达2年。请参见“标记抗体怎样保存？”了解更多储存信息。

七、为什么标记了的抗体和未标记的实验效果不同？

答：在罕见情况下，标记标签可能会阻挡了抗体结合部位，因此限制了抗体与抗原结合的能力。虽然这种情况罕见，但是确实有可能影响抗体在各种应用中结合抗原的效果。由于我们没办法控制标签与抗体的结合过程，所以我们不可能完全确定他们结合的位置。

更多常见问题及产品请咨询Stressmarq代理商上海金畔生物

PeproTech GMP级别细胞因子常见问题解答

发表于由

PeproTech GMP级别细胞因子常见问题解答

很多客户在购买PeproTech GMP级别细胞因子的时候，多多少少会遇到一些问题，比如说它的作用，它的组成成分，产品运输等，多多少少都有点关注，那本文就把大家常见的PeproTech GMP级别细胞因子问题整理下来，做一个解答，希望能够帮助到大家。

1. 我可以使用PeproGMP®细胞因子进行研究性产品的GMP生产和商品化治疗产品的生产吗？

是的，PeproGMP®细胞因子可用于GMP级别生产研究性或已上市的临床产品，如细胞治疗、基因治疗、组织工程产品、复合制剂或其它先进的医疗产品。

然而，PeproGMP®细胞因子本身不是治疗性产品或辅药，因此不可直接用于人体。更多信息，请参阅美国药典(USP)第1043章：“用于细胞、基因和组织工程产品的辅助材料”，或联系PeproTech的质量保障部门。

2. PeproGMP®细胞因子的风险性归于哪类？

在美国药典(USP)第1043章中，PeproGMP®细胞因子的风险性被归为第2层级：

级别1：低风险，高质量的材料(治疗性药物或生物制剂，医疗器械)。

级别2：遵循GMP规范生产的低风险、充分鉴定过的材料，并意图用作辅助材料。

级别3：中等风险，不作为辅助材料使用。

级别4：高风险材料。

3. PeproGMP®细胞因子的生产设施是美国FDA认证过的吗？美国FDA是否检查过PeproTech？我们的质量保证(QA)部门如何确认PeproTech公司的资质以及PeproGMP®细胞因子是否合格？

美国FDA不对辅助试剂的生产设施进行检查或GMP认证。在某些国家，其国家监管机构对各类产品的GMP生产设施均进行检查和认证，但美国FDA的GMP检查仅限于治疗产品和医疗器械。

PeproGMP®细胞因子是在符合ISO 9001的质量体系下，遵循GMP管理规范进行生产的。生产、测试、标签和包装等各方面均受到PeproTech QA部门的严格控制、验证和监视。PeproTech对PeproGMP®产品线的所有产品均提供详细的产品分析报告(CoA)和安全数据说明书(SDS)。

4. PeproGMP®细胞因子是无动物源和人源成分的吗？

是的。PeproGMP®产品线中的细胞因子均是使用化学成分明确的培养基、酶和化学品生产出来的，其中没有一种原材料是动物或人源的。

5. PeproGMP®细胞因子与PeproTech研究级别细胞因子的生物活性一样吗？ 

一样的。PeproGMP®细胞因子在功能上与对应的科研级别细胞因子相同。

6. PeproGMP®细胞因子是如何运输的？

PeproGMP®细胞因子制成冻干粉后，能在很宽的温度范围内保持稳定，因此一般是室温运输。根据客户的要求，并加收额外费用后，这些产品也可以用冰袋或干冰运输。

详情请咨询PeproTech代理商–上海金畔生物