检测炎症小体的激活及监测方法

炎症小体的激活有多个重要的特征，如ASC斑点的形成、促炎性细胞死亡、具有生物活性的IL-1β/18细胞因子的分泌以及HMGB1的表达。为了检测这些关键的特征，InvivoGen开发了体外研究炎症小体激活中最常用的人源THP-1单核细胞系模型和广泛用于报告系统的人源HEK293胚胎肾细胞系所衍生的细胞工具。

检测炎症小体激活的方法

1.使用RT-qPCR检测NF-κB诱导的pro-IL-1β和NLRP3上调

2.使用荧光显微镜或流式细胞术监测细胞系中ASC斑点的形成

3.使用 Western blot 检测 caspase-1 的裂解或 pro-IL-1β/IL-18 的成熟

4.使用ELISA测定IL-1β、IL-18或HMGB1的释放

5.使用乳酸脱氢酶（LDH）测定或碘化丙啶（PI）染色法检测细胞焦亡

6.使用检测IL-1β、IL-18分泌的报告细胞系

以上方法各有利弊，可以适当的结合这些方法来检测炎症小体的激活。

实时监测ASC斑点

THP1-ASC-GFP Cells

THP1-ASC-GFP细胞可通过荧光显微镜观察活细胞中ASC斑点的形成。它们以依赖NF-κB的方式稳定表达ASC::GFP融合蛋白。在诱导剂如Poly(dA:dT)的刺激下，炎症小体的激活可以通过观察荧光ASC斑点的组装来分析，不会干预炎症小体的应答。

监测细胞焦亡

THP1-HMGB1-Lucia™ Cells

THP1-HMGB1-Lucia™细胞是一种可靠、方便的定量检测细胞焦亡的工具，能取代测定LDH活性的经典方法。此测定依赖于细胞溶解介导的HMGB1警报素，通过与Lucia荧光素酶的融合来测量其释放。THP1-HMGB1-Lucia™细胞经LPS启动和炎症诱导剂如Poly(dA:dT)处理后引发细胞焦亡，从而释放HMGB1::Lucia到细胞外环境中。通过测量QUANTI-Luc™检测试剂产生的光信号，可以简单监测上清液中HMGB1::Lucia的水平。

实时监测IL-1β和IL-18的分泌

InvivoGen已开发出报告细胞系，能简单、快速、可靠地检测和定量具有生物活性的人源（h）或鼠源（m）IL-1β和IL-18。这些细胞来源于人源胚胎肾HEK293细胞系。在激活细胞因子信号通路后，它们表达由NF-κB/AP-1诱导的分泌型碱性磷酸酶（SEAP）报告基因。使用QUANTI-Blue™溶液检测试剂可以很容易地监测上清液中的SEAP水平。

HEK-Blue™ IL-1β Cells& HEK-Blue™ IL-1R Cells

这些细胞可以监测样本中的hIL-1α/β、mIL-1α/β。两种细胞系均表达内源性人源IL-1受体（hIL-1R）。HEK-Blue™ IL-1β细胞对人源IL-1异构体的敏感性高于鼠源的异构体。我们建议使用此细胞系来进行人源炎症小体细胞实验(例如THP1衍生分析，见第6-7页)，测试上清液样本。HEK-Blue™ IL-1R细胞被稳定转染表达mIL-1R，赋予对mIL-1β更高的敏感性。因此，该细胞系更适合于从小鼠的血清或细胞突变物中检测IL-1β。然而，它们的高灵敏度可以导致一些细胞（例如RAW264.7衍生细胞）出现高背景。

值得注意的是，这两种细胞系都可以用来评估样本中IL-1α警报素的水平。HEK-Blue™ IL-1β 和 HEK-Blue™ IL-1R细胞检测一种亚型的特异性可通过在分析中加入针对另一种亚型的中和抗体来评估。

HEK-Blue™ IL-18 Cells

这些细胞提供了一个强大的细胞实验平台，监测样本中hIL-18和mIL-18的浓度。HEK-Blue™ IL-18细胞经转染稳定表达hIL-18受体。这些细胞对hIL-18比mIL-18敏感。

使用Invivogen的细胞因子传感器细胞

1.检测具生物活性的细胞因子

2.具成本效益

3.短时间的实验操作

4.肉眼可视化实验结果

5.高灵敏度、高动态范围

6.适用于药物筛选（正常或高通量筛选、药物效应动力学等）

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文献参考：

Martine P. et al. 2019. Cell Death Dis. doi: 10.1038/s41419-019-1491-7. HSP70 is a negative regulator of NLRP3 inflammasome activation.

Metho S. et al. 2019. Mol. Cell. doi: 10.1016/j.molcel.2018.11.08. The Crohn’s disease risk factor IRGM limits NLRP3 inflammasome activation by impeding its assembly and by mediating its selective autophagy.

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研究炎症小体的未来趋势如何？

炎症小体是一种胞浆蛋白复合物，能够快速识别及抵御微生物和非感染性的侵袭。它们充当信号枢纽来诱导炎性细胞因子的成熟和分泌，继而引发免疫原性细胞的溶解性死亡，即细胞焦亡。

过去二十年间，研究人员在免疫细胞和非免疫细胞都发现多种炎症小体的传感器。这显示炎症小体是先天免疫防御的重要前哨，其激活有助清除病原体。虽然如此，它也可在自体炎症、神经退行性疾病和代谢性疾病等条件下导致无菌的炎症反应发生。相关疾病的例子有痛风性关节炎、阿尔茨海默病和2型糖尿病。此外，炎症小体在癌症中具有双向作用，既可以保护宿主，也可以促进肿瘤生长。

NLRP3是典型炎症小体的代表，且最为广泛研究，并与多种疾病和症状紧密关连。虽然其确实的激活机制仍存在争议，NLRP3已是开发炎症小体调节剂的生物技术公司中的热门靶点，如Inflazome、IFM Therapeutics、Nodthera和Jecure这些公司都专注于NLRP3的小分子拮抗剂的开发。在患上高死亡率疾病越趋普遍的现代社会中，这种拮抗剂可能成为理想的治疗药物。

虽然我们在理解炎症小体及其对人体健康和疾病的影响上取得了重大进展，但仍有些问题尚未解开。例如各种炎症小体传感器在多大程度上参与了先天免疫防御？炎症小体是专门针对某一特定的威胁，还是能协同发挥作用？大量的研究工作已经反映了调节炎症小体的复杂性，为开发介入治疗开辟了新的途径。

炎症小体的黄金时代尚未到来……

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炎症小体与疾病

在过去的一个世纪，现代社会已经历疾病转型，非传染性疾病正式取代传染性疾病成为主要死因。大多数的非传染性疾病与炎症小体有关，其中NLRP3与许多病理学有密切关系。现时临床上使用不同的方法来克服炎症相关疾病对公共卫生带来的巨大影响。

非传染性疾病

NLRP3的功能获得型（gain-of-function）突变可以导致如Cryopyrin相关的周期性综合征（CAPS）的自身炎症性疾病。其他炎性症状包括2型糖尿病、痛风性关节炎、癌症、心血管疾病和阿尔茨海默氏症，都是与NLRP3介导的慢性炎症反应有关，这些炎症继发于无菌危险信号在组织的积累 [35]。另外，白癜风、艾迪生病和1型糖尿病等自身免疫疾病与NLRP1的单核苷酸多态性有关 [46]。家族性冷性自身炎症综合征（FCAS）、小肠结肠炎和复发性巨噬细胞活化综合征（MAS）则与NLRC4的突变有关 [15]。而Pyrin的功能获得型基因突变与家族性地中海热（FMF）相关 [15]。

细胞因子风暴

炎症细胞因子的过度分泌可导致器官衰竭和死亡。NLRP3诱导的炎症反应失调与中毒性休克样症状（如链球菌中毒性休克样综合征（STSLS））[102]以及急性呼吸窘迫症状（如SARS-CoV-2病毒所引起的新型冠状病毒肺炎（COVID-19））等有关 [103]。

治疗方法

大多数临床认可的治疗方法旨在阻断炎性IL-1β/IL-1R信号。重组人源IL-1R拮抗剂Anakinra、抗IL-1β单克隆抗体Canakinumab和人源IL1R-Fc融合蛋白Rilonacept均有效治疗CAPS。这些药物也可能有助于代谢性和神经退行性相关炎症 [36]。另一方面，类似于IL-1阻断剂，靶向IL-18信号的Tadekinig alfa和GSK1070806已进入临床试验阶段 [36]。然而这些药物有其局限性，包括缺乏特异性靶点和增加感染风险。目前另一个有望的治疗方法是使用特定炎症小体传感器作为药理学抑制剂，其中一种特殊的NLRP3抑制剂MCC950是重要的例子 [99, 100]。它的效率在小鼠炎性疾病模型中得到了证实，并已在类风湿关节炎的II期临床试验中测试。虽然MCC950被发现会引起肝脏毒性 [35, 36]，但它成功帮助研究人员改良出更有效安全的分子。

重要的是，慢性炎症亦可导致癌症。一旦建立了肿瘤，它会生长在抑制性环境中以逃避免疫反应。因此，诱导细胞焦亡的化合物有望杀死癌细胞并改善抗肿瘤T细胞反应 [104]。

参考资料：

15. Xue, Y., et al., Trends in Immunology, 2019. 40(11): p. 1035-1052.

35. Mangan, M.S.J., et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2018. 17: p. 588.

36. Chauhan, D., L. Vande Walle, and M. Lamkanfi, Immunol Rev, 2020. 297(1): p. 123-138.

46. Platnich, J. and D. Muruve, Archives of Biochemistry and Biophysics, 2019. 670.

102. Lin, L., et al., PLOS Pathogens, 2019. 15(6): p. e1007795.

103. Freeman, T.L. and T.H. Swartz, Frontiers in Immunology, 2020. 11(1518).

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