炎症小体的激活与组装

炎症小体依赖于一个“两步”活化模型。不过每个炎症小体都有独特的传感器激活和平台关联机制。这些传感器既可以直接与它的激动剂结合，也可以依赖于另一种分子。ASC接头蛋白对于某些炎症小体的组装是必需的，但也可以不参与或完全缺乏于某些炎症小体的组装。不同炎症小体之间的相互作用通过特定的保守结构域发生。各种激活和组装策略可能经进化，演变成能对威胁做出及时的响应。

“两步”激活模型

启动（Priming）和激活是所有炎症小体都需要的两个步骤。首先，启动步骤可以视为一种必要的调节，以避免不必要的激活。它允许炎症小体组装和下游信号所需蛋白的转录上调。一旦启动，传感器将保持在自动抑制但对信号敏感的状态。它们通过直接的配体结合或间接的细胞内事件被不同的PAMPs或DAMPs激活。

第二步激活，是诱导启动后的传感器进行翻译后修饰（PTMs），导致去抑制的构象变化。这是传感器寡聚化和炎症小体平台组装的起点。下文我们详细介绍了NLRP3、NLRC4和CASP-11/4/5炎症小体的独特激活和组装机制。

NLRP3炎症小体

NLRP3炎症小体是最被研究透彻的经典炎症小体。然而，关于NLRP3激活的确切机制仍存在争议 [5, 38]。NLRP3可以被一系列结构上和化学上无关的刺激物激活。这些刺激物可以是无菌的（例如尿酸晶体、β-淀粉样蛋白、胆固醇晶体）、来自微生物（例如造孔毒素、离子通道激活剂）或环境的（例如石棉、二氧化硅）[5]。目前的认知是NLRP3不直接与这些分子结合。相反，它感知下游细胞溶质应激信号，如K+ 外排 [5, 38]、外化线粒体心磷脂和氧化线粒体DNA，后两者在一些研究中被认为是NLRP3的“最终”配体 [39-41]。

NLRP3是一种拥有三个结构域的蛋白，包含LRR、NOD（或NATCH）和PYD结构域（见第4页）。由于NOD和LRR结构域之间的内部相互作用，NLRP3被自动抑制为闭合构象 [42]。NOD结构域的ATP结合和水解允许NLRP3变成开放构象 [43]。此外，PTMs由不同的刺激物驱动，这些刺激物可以靶向NLRP3结构域中的特定残基 [38, 44, 45]。例如PRR配体（如LPS或Pam3CSK4）的刺激，可以在NOD结构域中导致JNK1介导的S198磷酸化以及NLRP3去泛素化 [44]。一旦LRR结构域被暴露，它就与NEK7（NimA相关蛋白激酶7）结合。NEK7对于桥接相邻NLRP3亚单位之间的间隙是必需的，不过，这种相互作用发生的时间和位置尚未完全阐明 [25-27]。NLRP3的激活会使炎症小体开始组装。NLRP3-PYD结构域招募ASC，然后通过其CARD结构域与pro-caspase-1结合。CASP-1受邻近诱导进行自溶性活化，从而使细胞表面形成GSDMD孔，允许IL-1β/IL-18和警报素分泌，最终导致细胞焦亡 [5, 46]。

细胞器在NLRP3炎症小体组装中起关键作用 [5, 47]。启动和激活信号一同协调NLRP3炎症小体成分在线粒体、内质网（ER）和高尔基体的亚细胞定位。至于是否存在多种细胞器的机制去调控NLRP3炎症小体组装则还在研究中 [48]。

NLRP3炎症小体已被发现有不同的启动机制。长时间的TLR刺激（>3小时）可以触发NF-κB介导的新NLRP3分子转录 [44, 49]。短时间的TLR刺激（<1小时）较可能触发MyD88或TRIF介导的NLRP3蛋白PTM [44, 50]。PTM介导的NLRP3启动可能已经进化到允许即时的炎症反应发生。另外，转录介导的启动可以通过上调NLRP3和效应分子的表达，来增强炎症反应。近期也有研究显示，至少在体外的人类单核细胞中，TLR介导的启动对于NLRP3炎症小体的活化并不是必需的 [51]。

重要的是，非经典炎症小体CASP-11/4/5炎症反应也能触发NLRP3炎症小体的激活和组装（见下文）。

NLRC4/NAIP炎症小体

NLRC4感测细胞内细菌分子，如属于运动器官的鞭毛蛋白，或来自细菌III型或IV型分泌系统(T3SS或T4SS)的内杆和针状蛋白。更具体地说，NAIP与其相应的配体直接结合后，再结合NLRC4。另外，人源和鼠源的NAIP表达存在差异。人源基因组只表达一种NAIP，作用于NLRC4上游并与上述激活剂结合 [7, 52]。这种独特的人源NAIP存在两种异构体，且对感知鞭毛蛋白和T3SS蛋白有不同的亲和力 [52]。而小鼠表达多个NAIPs，它们对每个配体都表现出不同的亲和力；例如NAIP1对T3SS针状蛋白具有较高的亲和力，NAIP2对T3SS内杆蛋白具有较高的亲和力，NAIP5和NAIP6对鞭毛蛋白具有较高的亲和力 [8-11]。尽管NAIPs和NLRC4的转录调控仍缺乏文献记载，但最近发现鼠源NAIPs的本底表达至少依赖于IRF8 [53] 。

NAIPs和NLRC4拥有相似的LRR和NOD结构域，其中LRR结构域是令它们处于自抑制状态所必需的 [8, 54-56]。此外，NLRC4还有一个CARD 结构域。一旦配体结合到NAIP的NOD区域，处于自抑制状态的NAIP就会伸展出来，暴露出NOD结构域 [55]。被激活的NAIP通过NOD-NOD相互作用募集NLRC4启动子（promoter），迫使NLRC4开放。而活化的NLRC4利用其暴露出来的NOD表面与其他NLRC4分子发生骨牌反应，形成组装炎症小体平台 [56]。NLRC4的CARD结构域聚集后会使NLRC4聚合化，NLRC4/NAIP复合物然后可以通过直接的CARD-CARD相互作用或通过ASC接头蛋白与pro-caspase-1结合 [15, 56]。

CASP-11和CASP-4/5非经典炎症小体

鼠源CASP-11和人源CASP-4/5同时作为传感器和效应蛋白分子，形成非经典炎症小体。CASP-11是在感染革兰氏阴性细菌小鼠模型中首次被发现能感应细胞内的LPS，且不依赖于细胞表面的LPS受体TLR4 [57, 58]。此外，CASP-11和CASP-4/5会驱动GSDMD介导的细胞死亡和CASP-1依赖性的IL-1β/IL-18分泌 [22]。

LPS的识别和caspase的寡聚化都是被CASP-11/4/5的CARD结构域所介导，它们也是使其自身亚单位进行自催化激活所必需的 [29]。这些活化的caspase会切割GSDMD，最终诱导细胞焦亡的发生。与CASP-1不同，CASP-11/4/5不会将pro-IL-1β和pro-IL-18切割成成熟形态 [59]。当质膜形成GSDMD孔，会释放出作为应激信号的胞浆成分。K+外排会促使NLRP3炎症小体组装和CASP-1介导的IL-1β/IL-18分泌 [38, 60]。不过，关于CASP-11/4/5确切的激活机制仍需要进行深入的研究。

细胞外LPS通过细菌OMV的摄取（见第13页）或细胞内细菌的溶解进入胞质 [57, 61]。之后的事件会涉及鸟苷酸结合蛋白（GBPs）和干扰素反应基因B10蛋白（IRGB10）的参与。GBPs积聚在吞噬体膜上，促使细菌产物（如DNA、LPS）释放到细胞质中 [62]。它们会通过招募IRGB10参与穿透细胞内细菌膜 [63]。GBPs也被认为能促使CASP-11与LPS疏水脂质A的相互作用 [64]。

人源CASP-4/5和鼠源CASP-11的本底表达会因细胞类型而有所不同，它们的表达可在使用各种TLR激动剂(如LPS和Pam3CSK4)和干扰素（IFN-β和IFN-γ）预处理后获得上调 [22, 65-67]。同样，GBPs和IRGB10也受干扰素转录调控 [67]。

既然人类基因存在着两种CASP-11相似的蛋白，这就引申出CASP-4和CASP-5在功能上是否具冗余性的问题。目前有体外实验显示要应答转染的LPS，最低限度也需要CASP-5，但在小鼠感染伤寒沙门氏菌的情况下CASP-5则是必需的 [68]。CASP-4和CASP-5在体内细菌感染中的确切作用还待进一步研究。

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参考资料：

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炎症小体检测细胞系&报告基因细胞系

炎症小体是由传感器（AIM2、Pyrin、NLRP1、NLRP3或NLRC4）、适配器（ASC：凋亡相关斑点状蛋白）和caspase-1前体蛋白组成的复合体。

它们的多聚体会催化caspase-1的自激活、IL-1β和IL-18的蛋白分解成熟，以及Gasdermin D（GSDMD）的裂解。细胞膜上GSDMD孔的形成会迅速引起细胞焦亡和IL-1β、IL-18和HMGB1的释放。

所有细胞系的生物活性均经过严格的qPCR和功能测试分析。

评估炎症小体的激活

炎症小体的激活有多个重要的特征，如ASC斑点的形成、促炎性细胞死亡、具有生物活性的IL-1β/18细胞因子的分泌以及HMGB1的表达。

为了检测这些关键的特征，InvivoGen开发了体外研究炎症小体激活中最常用的人源THP-1单核细胞系模型和广泛用于报告系统的人源HEK293胚胎肾细胞系所衍生的细胞工具。

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炎症小体的研究

Figure: Mouse caspase-1 is detected in cell culture supernatants by ELISA using caspase-1 (mouse)  Matched Pair Detection Set (Prod. No AG-46B-0003).	Adipogen公司也可提供多种炎症小体信号相关的研究试剂  定量检测炎症小体的活化  产品名称：Caspase-1 (mouse) Matched Pair Detection Set  产品编号：AG-46B-0003-KI01   规格：1 Set  特 异 性： Detects mouse caspase-1 (p10 and p20 domain).  Does not detect human  caspase-1.  反 应 性： Mouse  灵 敏 度： 100pg/ml  检测范围： 0.15ng/ml to 10ng/ml  样本类型： Cell Culture Supernatant

Figure: Mouse caspase-1 (p10) is detected by immunoblotting using anti-Caspase-1 (p10) (mouse), mAb (Casper-2) (Prod. No AG-20B-0044).

用于检测活化的小鼠Caspase-1(p10&p20)的特异性单抗  产品名称：anti-Caspase-1 (p10) (mouse), mAb (Casper-2)  产品编号： AG-20B-0044-C100 100 μg，AG-20B-0044B-C100  Biotin  100 μg  克隆号： Casper-2  亚型： Mouse IgG2a  免疫原： Recombinant mouse caspase-1  应用： WB (1μg/ml)  特异性： Recognizes endogenous full-length and activated (p10 fragment) mouse caspase-1.

研究新进展—粘膜微环境里中性粒细胞炎症在病毒易感性中的作用

为什么有些人接触病毒后会生病，而有些人不会？虽然一些证据指出了可能由于暴露的持续时间或先前感染产生的抗体导致，但可变传播的生物学基础仍不完全清楚。为了弄清这个问题，由Peter Openshaw博士领导的伦敦帝国理工学院的研究小组开始了他们的研究，他们用呼吸道合胞病毒(RSV)感染健康志愿者，这种病毒在成人中会引起轻微症状，但在婴儿中会很严重。在志愿者接种病毒之前，从他们的鼻粘膜中提取样本。在纳入研究的58名志愿者中，57%出现症状。对感染前样本的RNA表达分析表明，最终患病的个体在感染前表达了炎症性的中性粒细胞信号。此外，那些没有出现症状的人在感染后采集的样本中显示出先天免疫活性水平增加。这些结果表明，感染前粘膜中存在的中性粒细胞炎症可能是决定谁易受感染的重要因素。

该研究团队首先研究了人类志愿者，然后用小鼠模型验证了他们的发现，他们使用一种中性粒细胞化学吸引剂CXCL1来模拟在人类志愿者中看到的中性粒细胞的增加。感染前给予小鼠CXCL1，小鼠病情加重可见CD8+ T细胞浸润。研究人员使用Bio X Cell的anti-mouse Ly6G antibody用于耗尽CXCL1处理的RSV感染小鼠的中性粒细胞。这些小鼠比用同种型对照治疗的小鼠患病更少，证实了感染前鼻粘膜中性粒细胞的增加导致对病毒感染的易感性。研究人员使用Bio X Cell的anti-mouse CD8 antibody来耗尽CXCL1处理的小鼠中的CD8+ T细胞，RSV感染的小鼠也导致不太严重的疾病，证明CD8+ T细胞介导疾病的严重。

以上研究成果发布在Science杂志题为 ” Neutrophilic inflammation in the respiratory mucosa predisposes to RSV infection” 文献中，该研究小组使用了Bio X Cell的 anti-mouse Ly6G (clone 1A8)和anti-mouse CD8 (clone YTS169.4)抗体来帮助确定中性粒细胞炎症是呼吸道感染易感性的重要组成部分。该项研究成果表明了在呼吸道感染了解粘膜微环境的重要性，并强调了局部干预的目标，这可能会增强对一系列呼吸道病原体的抵抗。

文章原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.aba9301

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炎症小体传感器和接头蛋白

炎症小体是由细胞内的传感器和连接着接头蛋白的炎性caspase共同组成的多蛋白复合物。它们的组装可以由多种微生物和宿主源性刺激物触发。一旦炎症小体被激活，它们就会在细胞表面形成Gasdermin-D膜孔，允许非经典分泌IL-1β和IL-18促炎细胞因子、IL-1α和HMGB1警报素蛋白，最终导致细胞焦亡。当炎症小体的组装需要caspase-1时，它们属于“经典”的炎症小体；当炎症小体的组装依赖于人源caspase-4或caspase-5（或它们的小鼠同源蛋白caspase-11）时，则为“非经典”的炎症小体。

炎症小体传感器

炎症小体是根据其传感器命名。这些传感器主要是以蛋白质结构域分类的细胞质模式识别受体（PRRs）。大多数PRRs都是属于NLR（核苷酸结合域（NBD）和富含亮氨酸重复序列（LRR）受体）家族，特别是NLRP和NLRC亚群。NLRPs与NLRCs的差异在于其N-末端的pyrin结构域（PYD）和 caspase募集结构域（CARD）。NLR传感器包括NLRP3、NLRP1和NLRC4能够形成炎症小体。其他非NLR传感器也可以形成炎症小体，如AIM2和Pyrin。不论是否有ASC接头蛋白，这些传感器可以通过招募caspase-1（CASP-1）引发经典炎症小体的组装。至于非经典炎症小体的组装涉及同时具有传感器和效应蛋白功能的人源CASP-4/5或鼠源CASP-11。

经典炎症小体传感器

NLRP3（又名cryopyrin或NALP3）是自Tschopp团队在2004年发现其炎症小体组装功能以来最为广泛研究的传感器 [1]。这种LRRNOD-PYD传感器可被多种结构和化学上不相关的刺激物激活（如造孔毒素、离子通道激活剂、尿酸晶体、β-淀粉样蛋白）[2-4]，显示出NLRP3不会直接与这些分子结合。NLRP3反而感测下游细胞应激信号，例如离子失衡，尤其感测可能造成细胞内稳态絮乱的K+外排 [5]。重要的是，NLRP3参与多种疾病的炎症病理过程，包括阿尔茨海默病、2型糖尿病和COVID-19（咨询上海金畔生物获取更详细资料）。

NLRC4（又名Ipaf）是在2004年首次被Dixit团队报道其引发炎症反应的作用 [6]。后来，Vance和Shao团队更证实NLRC4是一种间接传感器，与NLR家族凋亡抑制蛋白（NAIPs）有相互作用。NLRC4可以直接与细胞内的细菌（如鞭毛蛋白）和细菌分泌系统的组成部分（如内杆和针型蛋白）产生的PAMPs结合。虽然人源NLRC4的上游只有一种NAIP蛋白去识别这些PAMPs的激活分子 [7]，但研究显示，小鼠拥有多个NAIPs基因，不同的NAIPs蛋白在识别不同PAMPs分子有偏好性 [8-11]。此外，NLRC4炎症小体亦表现出可以保护肺部、胃部和肠道中的粘膜屏障免受细菌入侵 [12]。

NLRP1（又名NALP1）是NLR家族第一个被发现的炎症小体传感器，在2001-2002年被Tschopp团队描述了其特征 [13, 14]。人源NLRP1具有一个CARD和一个PYD结构域；而鼠源NLRP1的旁系同源基因（a，b，c）则欠缺了PYD结构域，这些同源基因当中尤其以NLRP1b最为研究透彻。另外，人源和鼠源NLRP1都有一个位于CARD上游的独特FIIND（function to find domain）结构域。尽管目前仍然没有辨别出NLRP1的同源配体 [15, 16]，但已知的是NLRP1b的活化由致病酶（例如炭疽杆菌致死因子或弗氏志贺菌IpaH7.8）所诱导，这些致病酶会触发FIIND结构域的自切割和N末端结构域的蛋白酶体降解 [16]。 

AIM2（黑色素缺乏因子2）是一种含有PYD结构域和寡核苷酸结合结构域的非NLR蛋白。AIM2是微生物或宿主来源（细胞损伤后）的细胞质双链DNA（dsDNA）的受体，其识别不依赖特定的DNA序列顺序，但依赖于序列的长度 [17-19]。虽然有研究证实AIM2在鼠源骨髓细胞中形成炎症小体的功能，但在人源细胞的形成机制则尚未明确 [19-21]。

Pyrin最初是在携带MEFV基因突变的家族性地中海热（FMF）患者中发现。现时除了知道它的激活涉及其PYD结构域外，还未完全清楚它的激活机制。此外，尽管它已被证明能感应细胞骨架动态的异常变化，并能被Rho修饰蛋白（例如艰难梭菌毒素B和肉毒梭菌毒素C3）激活 [15]，但它的同源配体仍然不明。

NLRP6 和 NLRP9b 传感器越来越受到关注，有数个研究显示它们介导了小鼠的炎症反应，尤其是在肠上皮细胞中的炎症反应 [15]。

非经典传感器

人源caspase-4和caspase-5（CASP-4/5）和鼠源caspase-11（CASP-11）拥有双重功能。它们既是细胞溶质脂多糖（LPS）直接的受体，也是炎症小体直接的效应蛋白。更确切地说，CASP-11/4/5形成非经典炎症小体，导致CASP-1依赖性的IL-1β和IL-18分泌，以及CASP-1非依赖性的细胞死亡 [22, 23]。

知识点：“经典”和“非经典”的术语不仅指炎症小体的类型，还指导致炎症小体激活的途径类型。NLRP3和CASP-11分别形成经典和非经典炎症小体。然而，NLRP3均可以通过经典和非经典途径活化，详情请咨询上海金畔生物，获取更详细的资料。

接头蛋白 

ASC（凋亡相关斑点样蛋白）又名PYCARD，是由CARD和PYD结构域两部分组成的接头蛋白，允许传感器和pro-caspase-1之间的相互作用。这个蛋白是由不含CARD结构域的炎症小体传感器（如NLRP3和AIM2）所招募的。而NLRP1、NLRC4和CASP-11/4/5炎症小体的形成过程并不需要ASC [15, 23]。在静止细胞中，ASC作为可溶蛋白分散存在于细胞质和细胞核。当炎症小体被激活后，ASC分子会在每个细胞中聚集形成一个微米级的“斑点”，从而集中CASP-1的激活位点 [24]。

NEK7（NIMA相关蛋白激酶7）是一种与有丝分裂相关的丝氨酸苏氨酸激酶，最近被发现其为NLRP3炎症小体活化的必需蛋白，且作用于K+外排的下游。经体内和体外使用NLRP3激动剂刺激验证，NEK7的缺失会阻断CASP-1的激活和IL-1β的释放 [25]。有研究显示，NEK7通过结合LRR结构域，桥接相邻的NLRP3分子，从而发挥其支架功能 [26]。 

效应蛋白

Caspase-1（CASP-1）是一种半胱氨酸蛋白酶，最初被命名为白细胞介素-1β-转换酶（ICE）[27]。CASP-1由无活性的caspase-1前体（pro-caspase-1）生成，包含N端CARD结构域和两个催化亚基p20和p10。CASP-1通过其CARD结构域被招募到经典炎症小体。有研究显示，四聚体形式的CASP-1（以及CASP-4或-11）允许邻近诱导的自溶激活，释放p20和p10亚基 [28]。活化的CASP-1能够将pro-IL-1β和pro-IL-18细胞因子以及Gasdermin D切割为它们具生物活性的形态。目前还需要进行更多的结构研究去了解其确切的作用方式。

Gasdermin D（GSDMD）又名DFNA5L或FKSG10，于2004年首次被发现，但近10年来仍未清楚其生物学功能。这种细胞质蛋白含有两个被连接区域分隔的结构域，而C端结构域（GSDMD-CT）会抑制着N端结构域（GSDMD-NT）。活化的CASP-1或CASP-11/4/5会切割它们中间的连接区域，释放GSDMD-NT片段。GSDMD-NT其后与膜脂质结合，导致其寡聚化并在细胞膜上形成内径约为18 nm的孔 [30]。成熟的IL-1β、IL-18和警报素继而通过GSDMD孔分泌出来，最终GSDMD孔的积累会引致细胞焦亡。

白细胞介素（IL）-1β和IL-18是在许多炎症的激活和调节事件上起重要作用的细胞因子。IL-1β诱导包括发热、血管扩张、遭受感染或组织损伤后的免疫细胞浸润等的基因表达控制。IL-18除了是诱导干扰素-γ（IFN-γ）产生所必需的细胞因子外，也负责介导适应性免疫应答的共刺激性细胞因子。这两种细胞因子必须通过切割其pro-IL-1β和pro-IL-18的酶原前体才能产成成熟的形态 [31]。由于它们缺乏进入囊泡介导的生物合成途径所必需的N端信号序列，这些细胞因子会从非经典途径（即通过GSDMD孔）分泌。

警报素（Alarmins）是受损或死亡的细胞对感染或损伤作出反应时所释放的DAMPs。这些分子在体内稳态时以低水平存在于细胞质中，并随时准备在炎症小体应答时分泌。当它们的表达被上调，危险信号得以传播出去。其中IL-1α [32]和HMGB1（高迁移率族蛋白-1）[33]被认为是炎症小体激活时释放的两种主要警报素蛋白。

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