如何检测细胞培养中的真菌污染？

与支原体和细菌不同，真菌是真核生物。真菌可以作为圆形或椭圆形体（酵母）存在，可以形成链或簇，也可以是长的细丝（菌丝）24。菌丝在污染的后期呈现模糊斑块状形成霉菌24。真菌污染是细胞培养中的一个严重问题，能够影响实验结果的有效性。更重要的是，这类型的污染极难根除，因为真菌可以通过孢子随空气流动传播。许多真菌种类的休眠孢子能在极端恶劣和不良环境中存活，一旦它们遇到合适的生长条件时就会被激活。

如何检测细胞培养中的真菌污染？

酵母是最小的真菌（3-10 μm）。它们可以透过光学显微镜看到。依据大小和生长阶段的不同，菌丝在一些情况下可以用肉眼或光学显微镜检测到。在大量污染的情况下，菌落形成的霉菌会浮在细胞培养表面。在这种情况下，不要打开容器并丢弃培养物，以免传播孢子。有时候，培养基的pH值可能增加，导致含酚红的培养基呈现粉红色。

清除真菌预防和清除用的试剂

Fungin™

• 高效：杀灭真菌（酵母、菌丝和霉菌）

• 快速：5-10天拯救细胞培养

• 安全：对哺乳动物细胞毒性极低

• 可靠：可作为预防方案

Fungin™是一种抗真菌化合物，通过破坏细胞膜上离子交换来杀死不同形式的真菌（酵母、菌丝和霉菌）。Fungin™拥有高度的稳定性，不需要溶解在具有细胞毒性的脱氧胆酸盐（deoxycholate）中，因此是两性霉素B（Amphotericin B）的一个很好的替代品。可分别在低或高浓度下用于常规的预防性使用或去除污染，对细胞培养中常见的真菌污染物（如白色念珠菌和曲霉）提供了最大的保护，同时也可添加到含有常用抗菌剂（如青霉素和链霉素）的培养基中。Fungin™亦是被文献高频引用的抗真菌试剂。

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什么是支原体污染？支原体污染怎么检测？

支原体是最小和最简单的自我复制生命体。由于支原体体积小（100 nm），缺乏刚性的细胞壁，因此肉眼无

法检测到支原体，它们可以透过一般过滤膜，并对很多抗生素都具有抵抗力。支原体污染是细胞培养中的一

个主要问题，不止影响实验结果的有效性，更会影响细胞工程制药的质量和安全性。

支原体的特征

支原体属于柔膜菌纲，其成员特征为缺乏细胞壁以及拥有多变的形态。支原体对包括原代细胞在内的所有真核细胞类型具有高度传染性。成百上千的支原体可以附着在一个细胞上，与细胞膜融合、繁殖，最终数量可以超过培养细胞1000倍。支原体可以彻底改变细胞特性和扭曲研究结果。而支原体脂蛋白可被Toll样受体2（TLR2）识别并激活免疫细胞3。支原体没有细胞壁的特点使它们对常用的抗生素（如青霉素和链霉素）产生抗性。此外，它们的尺寸微小（~100nm），能够穿透过0.2μm的标准过滤膜。因此，我们需要采取预防措施来防止细胞培养物受到污染。

支原体污染对细胞功能的主要影响

支原体与宿主细胞竞争营养素和代谢物前体。因此，它们能改变许多细胞功能，影响到细胞代谢和细胞生长，最终导致细胞死亡。通过对受污染的人源细胞进行微阵列分析，科学家发现支原体严重影响数百个基因的表达，当中包括受体、离子通道、生长因子和致癌基因4。一旦与宿主细胞膜粘附或融合，支原体可以通过干扰信号级联和细胞因子产生，进一步损害细胞5。这些有害效应会强烈干扰实验数据，导致研究结果无

效，特别是当涉及表达TLR2的免疫细胞时，如巨噬细胞。

支原体污染的检测

InvivoGen提供两种支原体检测方法，令您能够及时抵御细胞污染。两种试剂均可快速和准确地检测出最常污染细胞培养的支原体物种。

MycoStrip™是一种能够“即时”（〜1小时）检测支原体基因组的免疫层析试纸，而PlasmoTest™是基于检测支原体脂蛋白的比色细胞分析法。

基因检测试纸条

MycoStrip™

• 适合用于即时测试

• 简单：无需特殊设备

• 快速：实际操作时间<15分钟，总时长约1小时

• 清晰：一条条带 – 支原体阴性 

 两条条带 – 支原体阳性

MycoStrip™基于等温PCR的技术，在加入我们专有的反应混合物后，靶向扩增细胞培养中，最常见（占95％）支原体物种的16S rRNA基因。在5分钟内免疫层析试纸条的显示区上就会出现检测结果的条带。

细胞比色分析法

PlasmoTest™

• 适合常规测试使用

• 简单：使用细胞培养上清液进行比色检测

• 快速：操作时间<1小时。过夜培养后可见结果

• 灵敏：培养上清液中检测限为 5.10（2次方） – 5.10（5次方） CFU/ml

InvivoGen拥有专利的HEK-Blue™-2细胞，稳定表达人源TLR2（支原体脂蛋白的主要识别受体1

）,以及一个NF-κB诱导的分泌型胚胎碱性磷酸酶（SEAP）报告基因。HEK-Blue™-2细胞可直接在HEK-Blue™检测培养基中培养，便于检测，是常规检测的理想选择。简单向这些细胞添加测试样品则可以得到比色结果，其灵敏度与基于生物化学发光的分析法相近。培养上清液样品中SEAP报告基因的活性可使用分光光度计在620-655nm下测量。而吸光度与污染物的量成正比。为了您的方便，HEK-Blue™-2细胞会附送Normocin™。Normocin™是一种抗生素混合物，能够防止细胞培养受到支原体、细菌和真菌的污染。

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细胞培养污染指南

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拒绝微生物污染 保卫细胞

What is hiding in your cells?
Be vigilant to keep them safe.
在科研实验中，微生物污染是细胞培养过程中面临的一项长期的严重威胁。侵入的支原体、细菌、酵母菌和真菌可以直接杀死您宝贵的细胞或者彻底改变培养细胞的特性，导致不准确的实验结果，既耗费时间又浪费资源。InvivoGen可以提供多种特异性的产品帮助您在科研实验中预防、检测和去除微生物污染。

▲  高效、 快速的抗微生物试剂

▲ 选择性强: 对真核细胞无毒

▲ 严格的质量监控

保护您的细胞不受污染，从这里开始 

*既能作用于支原体，也作用于其他类型的微生物。

Plasmocin™ prophylactic – 预防支原体污染。包含2种杀菌成分: 一种作用于蛋白质的合成，另一种干扰DNA的复制。
Normocin™ – 预防支原体、细菌和真菌污染。3种抗生素的新型配方，可直接添加于小型或大规模的动物细胞培养中。 Normocin™包含2种成分可通过阻断DNA复制和蛋白质合成杀灭支原体和革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌。
Primocin™ – 预防原代细胞的支原体、细菌和真菌污染。首次为原代细胞提供完整的预防微生物污染的配方。使用Primocin™后，不需要再添加青霉素/链霉素 (Pen/Strep)。
Fungin™ –预防和去除酵母菌和真菌污染。新型可溶性那他霉素，可直接添加于小型或大规模的动物细胞培养中。Fungin™ 可以替代两性霉素B的使用。

Plasmo™ Test – 检测支原体污染。为您的细胞培养实验提供简单、快速、可靠的可视化支原体检测分析。PlasmoTest™是首例采用细胞培养检测支原体的方法。
Plasmocin™ treatment- 去除支原体污染。使用浓度高于Plasmocin™ prophylatic, 仅需2周即可完全消除支原体污染。
Plasmocure™ – 去除少数对Plasmocin™有抗性的支原体。包含2种抗生素，作用机制与Plasmocin™不同。使用 Plasmocure™ 处理2周即可完全消除支原体污染。
Normocure™ – 去除革兰氏阳性和革兰氏阴性菌污染。不同于常规的青霉素/链霉素(Pen/Strep)，Normocure™对于多药耐药性菌都有杀伤作用。

 （为了保护细胞不受微生物的污染，首先要确保环境的无菌，用无菌的监测技术定期检测要培养的细胞和培养试剂是否有微生物污染。某些特殊情况下（如原代细胞），可在培养基中添加抗生素避免污染。污染必须今早发现。细菌和真菌的污染通常可以通过光学显微镜和肉眼观察到，严重时，培养基会变浑浊。然而，裸眼看不到支原体污染，甚至也无法通过光学显微镜检测。因此，支原体污染可能被长期忽视并且只能借助专门的技术和手段来检测。当怀疑有微生物污染时，建议使用无假阳性、结果清晰可辨的检测方法。一旦发现有微生物污染，请立即隔离或者挽救已污染细胞并避免污染扩散。）

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