支原体的特征及污染对细胞功能的主要影响

支原体是最小和最简单的自我复制生命体。由于支原体体积小（100 nm），缺乏刚性的细胞壁，因此肉眼无法检测到支原体，它们可以透过一般过滤膜，并对很多抗生素都具有抵抗力。支原体污染是细胞培养中的一个主要问题，不止影响实验结果的有效性，更会影响细胞工程制药的质量和安全性。

支原体的特征：

支原体属于柔膜菌纲，其成员特征为缺乏细胞壁以及拥有多变的形态。支原体对包括原代细胞在内的所有真核细胞类型具有高度传染性。成百上千的支原体可以附着在一个细胞上，与细胞膜融合、繁殖，最终数量可以超过培养细胞1000倍。支原体可以彻底改变细胞特性和扭曲研究结果。而支原体脂蛋白可被Toll样受体2（TLR2）识别并激活免疫细胞。支原体没有细胞壁的特点使它们对常用的抗生素（如青霉素和链霉素）产生抗性。此外，它们的尺寸微小（~100nm），能够穿透过0.2μm的标准过滤膜。因此，我们需要采取预防措施来防止细胞培养物受到污染。

支原体污染对细胞功能的主要影响：

支原体与宿主细胞竞争营养素和代谢物前体。因此，它们能改变许多细胞功能，影响到细胞代谢和细胞生长，最终导致细胞死亡。通过对受污染的人源细胞进行微阵列分析，科学家发现支原体严重影响数百个基因的表达，当中包括受体、离子通道、生长因子和致癌基因。一旦与宿主细胞膜粘附或融合，支原体可以通过干扰信号级联和细胞因子产生，进一步损害细胞。这些有害效应会强烈干扰实验数据，导致研究结果无效，特别是当涉及表达TLR2的免疫细胞时，如巨噬细胞。

检测支原体的 5 大原因：

1.珍贵细胞系的损失

2.对数据可靠性和再现性的严重影响

3.大多数学术期刊都要求进行测试

4.全球高达35%的污染率，包括细胞库

5.时间和金钱的损失

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确保细胞安全—预防，检测和清除微生物污染试剂

InvivoGen提供一系列高特异性产品帮助您预防，检测和清除微生物污染。欢迎选择我们针对真核细胞高效，快速且无毒的抗微生物（支原体，细菌，酵母和真菌）试剂。

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细菌污染的清除跟预防

Normocin™

污染预防试剂

• 广谱：杀灭支原体、细菌和真菌

• 安全：对哺乳动物细胞毒性极低

Normocin™是包含三种抗生素的创新配方，具有抗支原体、细菌（革兰氏阳性和革兰氏阴性）和真菌（包括酵母）的活性。它被广泛使用，并被引用为细胞培养基中的“常规添加物”以防止污染。Normocin™可与青霉素和链霉素（Pen-Strep）溶液结合使用，以扩大抗菌谱。Normocin™能提供最大限度的保护，并以最低的细胞毒性防止微生物污染。

Normocure™

多重耐药细菌去除剂

• 随时可用：直接添加到培养瓶

• 快速：3次传代内拯救细胞培养

• 安全：对哺乳动物细胞毒性极低

Normocure™是从革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，特别是抗青霉素和链霉素的非发酵革兰氏阴性细菌中拯救宝贵细胞系的最佳武器。Normocure™是由三种属于不同抗生素家族的成分组成的混合物。通过一次传代就可以清除99%以上的细菌污染物。这些抗生素的靶点在真核细胞中不存在，保证了Normocure™的低细胞毒性。

Primocin™

原代细胞抗菌剂

• 广谱：杀灭支原体、细菌和真菌

• 安全：对原代细胞无毒

Primocin™含有四种化合物，其中三种阻止了革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和支原体的DNA和蛋白质合成。第四种化合物通过破坏细胞膜的离子交换来根除真菌，包括酵母。Primocin™已成功用于许多原代细胞，包括鼠源和人源肿瘤源细胞系、胚胎细胞和诱导性多能干细胞。

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细菌污染概述&如何检测细菌污染？

细菌是广泛存在的单细胞微生物。它们的直径通常只有几微米，形状各异，从球状、棒状到螺旋状。细菌是细胞培养中最常见的生物污染物。尽管可以用光学显微镜进行检测，在污染的早期阶段，细菌很容易被误认为是细胞碎片。

您知道吗? 所有InvivoGen的细胞系都配备了NormocinTM，它是一种广谱的抗菌剂，以帮助您保护细胞的安全。

“污染嫌疑者”

常见的污染源？

实验室操作人员

葡萄球菌的主要源头。

脏水浴、恒温箱、玻璃器皿……

假单胞菌和黄杆菌的主要源头。

从动物组织分离出的细胞

共生菌群和/或无症状感染的源头。

让InvivoGen帮助保护您的细胞！我们提供文献高频引用的复合抗生素，以防止和清除广谱和多重耐药污染物。

如何检测细菌污染？

在污染的早期阶段，因为细菌比真核细胞（10-100μm）小得多（1-10μm），它们可能被误认为是细胞碎片。因此，在显微镜下使用相位对比（100x-400x）检查细胞培养是很重要的。您有没有看到小黑点、棒状物、螺旋状物？它们可以是单独存在，成链存在，或者成簇存在。它们是能活动的吗？如果答案是肯定的，您的细胞培养可能受到了污染。

由于细菌生长速度快，它们能在48小时内引起培养基的变化，细菌污染从105cfu/ml起变得肉眼可见，培养基呈浑浊状态。细菌代谢导致培养基pH值下降，如果含有酚红，培养基会从红色变到黄色表示pH值下降。最终，培养环境不再适合真核细胞导致其死亡。这些受污染的培养物应该被废弃，但如果它们是不可替代的话，

可使用InvivoGen的复合抗生素处理（见细菌污染的清除跟预防一文）。

1. Ryan J. 2008., 2.  Lincoln C. & Gabridge M. 1998., 3. Fogh J. 1973., 4. McGarrity 

GJ. & Coriell LL. 1971., 5. Gray JS. et al. 2010., 6 McGowan JE Jr., 2006.

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什么是内毒素污染？生物试剂内毒素如何检测？

内毒素污染

内毒素，又称脂多糖（LPS），是革兰氏阴性细菌的主要细胞壁成份。内毒素的来源包括培养基、血清、水、缓冲溶液和其他细胞培养试剂，如胰蛋白酶。内毒素是体内外炎症反应的有效诱导剂。内毒素污染是细胞培养和生产注射药物中的主要问题。溶液和试剂可能是无菌但仍含有细菌成分，因此监测细胞培养试剂中是否存在内毒素至关重要。

注意：“内毒素”有时候用于描述细菌其他组成部分（如鞭毛蛋白），但在细菌学中它仅指脂多糖。

LPS的基本结构

常见的内毒素污染源？

水 — 使用高纯度水制备培养基和溶液，清洁玻璃器皿。

玻璃器皿 — 为了消除内毒素，必须将玻璃器皿加热至250°C维持≥30分钟，或加热到180°C维持 3 小时1。

培养液、血清和添加剂 — 使用前要求制造商提供内毒素水平认证或测试。

塑料容器 — 要求制造商提供内毒素水平和无致热源的证明。

让 InvivoGen 保障您的安全 ！所有InvivoGen的试剂都经过彻底测试，以确保不存在细菌污染，包括内毒素。

我的实验有什么风险？

内毒素在体外和体内实验均可引起显著的不稳定性。脂质A部分能够激活细胞表面或内体的Toll样受体4（TLR4），诱导MAP激酶（MAPK）、NF-κB和IRF（干扰素调节因子）通路的激活。尽管内毒素的作用随浓度和细胞类型的不同而改变，但它们确实可以改变细胞形态、影响增殖和转染效率。此外，LPS还诱导了炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-18的产生，并激活caspase 4/5/11-NLRP3 非经典炎症小体，导致细胞焦亡。

在体内实验，低内毒素浓度可刺激免疫系统，而高浓度可引起发烧、低血压、多器官衰竭，甚至死亡。

内毒素在体内外的主要影响

1. Gorbet MB. & Sefton MV., 2005., 2. Leider, R. et al. 2013., 3. Nims, RW. & Price PJ. 2017., 4. Rathinam VAK. et al., 2019

生物试剂内毒素检测

HEK-Blue™ LPS 检测试剂盒 2

基于细胞的比色法分析

• 用途广泛：适用于几乎所有的生物试剂

• 高灵敏度：检测限为0.01 EU/ml

• 经济实惠：1个试剂盒最多可进行500次测试

HEK-Blue™ LPS 检测试剂盒2的原理

试剂盒依赖于InvivoGen专有的HEK-Blue™-4细胞，该细胞稳定表达人源TLR4和一个NF-κB诱导的分泌型胚胎碱性磷酸酶（SEAP）报告基因。

简单的实验程序使该试剂盒成为常规测试的理想选择。只要样品中含有微量的LPS，在与HEK-Blue™-4细胞孵育过夜后，会导致NF-κB的激活和SEAP报告基因的表达。培养上清液中的SEAP活性通过加上底物QUANTI-Blue™溶液，并使用分光光度计在620-655 nm的波长测量。吸光度与内毒素含量成正比。使用试剂盒中提供的HEK-Blue™内毒素标准品，经系列稀释获得标准曲线从而计算内毒素浓度（大肠杆菌055:B5 LPS的制备参照FDA批准的内毒素工作标准品（CSE）制备标准）。HEK-Blue™ LPS检测试剂盒2 在InvivoGen公司内部用作常规检测。

使用该试剂盒的5大原因

1.替代昂贵而耗时的鲎试剂（LAL）。

购买此套件一次，冻存HEK-Blue™-4细胞，以后只需重新订购其他耗材。

2.与LAL分析不同，如果样品含有(1,3)-β-D-葡聚糖，使用HEK-Blue™-4细胞进行LPS检测不会导致假阳性。

3.适用于所有生物样品，包括培养基、血清、化学制剂和疫苗佐剂。

4.溶液颜色从粉红色变为紫/蓝色表示 阳性反应，结果简单可视。

5.包括一本实验程序小册子，计算内毒素浓度的方法，以及疑难排解部分。

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支原体污染的检测

PlasmoTest™

细胞比色分析法

• 灵敏：培养上清液中检测限 5.10^2- 5.10^5 cfu/ml

• 可靠：无假阳性

• 快速：操作时间<1小时。过夜培养后可见结果

• 简单：使用细胞培养上清液进行比色检测

PlasmoTestTM 在细胞培养中的灵敏度

支原体物种 灵敏度 (cfu/ml)

Acholeplasma laidlawii  2.5 x 10^3

Mycoplasma arginini  2 x 10^3

Mycoplasma fermentans  5 x 10^2

Mycoplasma hominis  6 x 10^3

Mycoplasma hyorhinis  7 x 10^2

Mycoplasma orale  5 x 10^5

Mycoplasma salivarium  1 x 10^4

InvivoGen拥有专利的HEK-BlueTM-2细胞，稳定表达人源 TLR2（支原体脂肽的主要传感器）以及一个NF-κB诱导的SEAP（分泌型胚胎碱性磷酸酶）报告基因。HEK-BlueTM-2细胞可直接在HEK-BlueTM检测培养基中培养，便于检测，是常规检测的理想选择。向这些细胞中简单地添加测试样品可以得到比色结果，其灵敏度与基于生物化学发光的分析法相近。培养上清液样品中SEAP报告基因的活性可使用分光光度计在620-655 nm下测量。吸光度与污染物的量成正比。

使用PlasmoTest™的5大原因

1.PlasmoTestTM能检测所有引起细胞培养污染的支原体物种。

2.PlasmoTestTM的阳性结果（没有假阳性）能显示细胞培养受到支原体或细菌的污染（见常见问题解答）。

3.检测方法可在96孔板上进行，方便管理多个细胞系的实验室进行常规检测。

4.只需要购买此试剂盒一次，HEK-BlueTM-2细胞制备冻存可供以后使用。其他试剂能分开购买补充。

5.产品包括一本实验程序指南及疑难排解部分。

常用支原体检测方法

如何保持细胞培养无支原体污染?

常见问题

问： PlasmoTest™是否只检测活支原体？

答： PlasmoTest™检测支原体脂蛋白的存留，因此能够检测细胞培养中活的和死的支原体。

问： PlasmoTest™能否检测生物试剂如培养基或胎牛血清中支原体的存在？

答： 可以，检测灵敏度在培养基中为 10^3 cfu/ml 。在胎牛血清中为 10^4 cfu/ml 。

问： PlasmoTest™能否检测细胞培养物中的细菌？

答： PlasmoTest™的原理基于TLR2的激活,因此可以同时检测支原体和细菌污染物。而且相对于肉眼无法检测的支原体，细菌污染会导致细胞培养明显改变。

细菌生长可以导致pH值降低（培养液变为黄色）和培养液变浑浊。

问： 有没有一个最佳的波长来读取样品？

答： 620 nm到655 nm之间的任何波长都适合。

更多详情请咨询Invivogen代理商-上海金畔生物

了解细胞培养污染，保护您珍贵的细胞！

细胞培养中的微生物污染对于您的研究是一个严重和持续性的威胁。支原体、细菌和真菌的侵入可以杀死或彻底改变细胞培养，导致灾难性的结果，浪费时间和资源。这本手册(可联系上海金畔生物获取完整版)帮助您深入了解最有可能侵入您细胞培养的污染物，建立预防污染的良好操作规范，以及提供清除污染的解决方案。作为先天免疫和微生物学方面的专家，我们清楚知道这些污染物对于实验结果的威胁。虽然细菌和真菌污染一般肉眼可见，但支原体和内毒素污染不易被肉眼察觉，亦不会被一般光学显微镜观察到明显的特征变化。这些难以被检测到的污染物是一个严重的问题，因为它们可能导致数据被误解，许多已发表的研究可能已被涉及。因此，现在的学术期刊经常要求投稿作者检测细胞是否存在支原体和内毒素污染。此外，对于开发未来治疗方案的制药企业，细胞污染将严重损害它们的研究和声誉，造成难以负担的后果。在InvivoGen，我们追求卓越，致力为世界各地提供高质量的产品和无支原体污染细胞系。本指南将帮助您解决微生物污染每个阶段的问题，并指导您如何选择正确的InvivoGen产品来检测、清除和预防污染。

检测

防止及去除细胞污染的关键是尽早发现污染。基于微生物污染的性质，检测方法包括生物分析、PCR、荧光或化学染色、光学显微镜、比浊法、pH值测量或简单的目视检查。细菌和真菌通常可以通过光学显微镜识别。它们生长迅速，在48小时内（比如经过周末）即可达至肉眼可见的程度，被污染的培养基会显得浑浊或呈斑点状。随后，这些微生物可以用检测试剂盒进行鉴定。然而，支原体污染状态不能被一般肉眼和光学显微镜观察到，因此它们可能会在很长一段时间内不被注意到，并且只能通过专门的分析法来鉴定。不同的检测技术可以同时使用，以确保分析准确，特别是用于排除假阳性或阐明不确定的结果。

预防

了解微生物污染源对于减少细胞培养风险至关重要（见下文）。虽然不可能完全消除或隔离污染源，但您可以采取各种措施来预防污染。首先，确保您是在无菌环境中工作，并使用适当的无菌操作技术。第二，隔离任何从实验室外带进来的细胞，直到确认没有污染为止。第三，用光学显微镜和检测试剂盒定期监测细胞的情况。最后，您可以使用复合抗生素，例如InvivoGen提供的专为新培养细胞（原代细胞或克隆）预防难以检测的污染而设的配方。 

清除

一旦在细胞中检测到污染，通常的建议做法是丢弃细胞和培养基。然而，有时候我们会遇到一些不能废弃的珍贵细胞（如单克隆稳定细胞株、来源于移植组织的细胞系、原代细胞），而且没有任何冻存（如尚未制备冻存细胞）。

在这种情况下，可以使用InvivoGen提供的抗生素，在不损害细胞的情况下，快速、可靠地清除污染。

实验室常见微生物污染源

1. 基础设施:

通风柜、排风装置和实验室设备可以容纳表面微生物并传播空气微生物。

每天用酒精清洁工作区和每月用漂白剂清洁工作区。定期更换所有空气过滤器，并至少每周清空所有真空吸液器。

2. 操作员：

实验室工作人员可以将皮肤、衣服和身体上带有的微生物和灰尘传播到培养细胞中。

穿上合适的安全服，使用无菌技术。

3. 移液枪、枪头、注射器、

真空泵：受污染的移液枪可以污染多个细胞。

使用无菌移液枪、针头和注射器，不要重复使用一次性器具。确保定期清空和清洁真空泵储液罐和管路。

4. 设备： 

玻璃器皿、培养箱和水浴锅很容易被污染。

保持所有设备无菌，经常更换水浴锅中的水（这是真菌的温床）。定期对所有培养箱进行消毒。

5. 安全服：

实验袍和手套必须保持清洁干净，只能在实验室穿上跟戴上。

不重复使用一次性防护服，用后立即丢弃。

6. 培养基、试剂和细胞：

使用任何培养基、试剂或细胞之前，确认它们是无菌的。小心密封所有容器。

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