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CUT&RUN的8个基本步骤

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CUT&RUN的8个基本步骤

CUT&RUN的8个基本步骤


CUT&RUN只包含几个基本步骤！

第一步

分离细胞并固定到刀豆蛋白（ConA）磁珠上

第二步

透化细胞

第三步

加靶标特异性抗体孵育

第四步

pAG-MNase结合

第五步

pAG-MNase激活

第六步

DNA纯化

第七步

CUT&RUN文库构建

第八步

Illumina®下一代测序

具体信息请见下方~

 

步骤1：分离细胞并固定到刀豆蛋白（ConA）磁珠上

将细胞（或细胞核）与ConA包被的磁珠结合，ConA是一种与细胞表面蛋白结合的凝集素。该步骤不仅支持高通量方法，而且简化了后续从染色质片段里分离细胞的操作。

避免磁珠干燥或结块在本步骤中非常重要，因为这会导致样品损失并降低产量。关于确认细胞完整性及与ConA磁珠结合情况的重要质量控制检查信息，可以点击此处获取。除此之外，高质量的样本准备对CUT&RUN的成功也至关重要，某些类型的样本可能需要进行一定处理后方可使用，详情可点击Sample Prep查询。

 

步骤2：透化细胞

由于洋地黄皂苷是一种非离子生物洗涤剂，可在低浓度下透化细胞膜。因此，在本步骤中使用含有洋地黄皂苷的缓冲液对固定好的细胞进行透化处理。透化处理对于抗体与pAG-MNase的结合至关重要，并且为后续MNase消化获得的DNA能够扩散到溶液中提供先决条件。洋地黄皂苷的用量必须根据所用细胞的类型进行优化，以免在实验中细胞出现裂解或不完全透化的情况，关于优化处理的详细信息，请点击此处了解。

 

步骤3：加靶标特异性抗体孵育

将目标靶标的抗体添加到反应中，并在4℃下孵育过夜。我们建议每个实验中设置阴性对照（如IgG）和阳性对照（如H3K4me3）反应。

抗体的特异性和结合效率对于CUT&RUN的成功至关重要。事实上，这种检测的背景非常低，以至于低效率的抗体无法达到足够高的产量进行PCR和测序。相反，非特异性抗体可能会提供相当好的产量，但会导致错误的生物学解释。详情参考抗体选择和检测控制的附加说明。

 

步骤4：pAG-MNase结合

第二天，洗涤与磁珠结合的细胞，除去未结合及非特异性结合的抗体。在没有钙离子（Ca2+）存在的条件下，将pAG-MNase添加到反应体系中，以防止MNase的过早激活。pAG的免疫球蛋白结合特性会将MNase“栓”在抗体结合的染色质上。pAG-MNase孵育后，多次洗涤细胞/磁珠混合物，以去除过量的pAG-MNase，防止非特异性切割。

 

步骤5：pAG-MNase激活

向反应中加入Ca2+以激活MNase，MNase会在抗体结合处的两侧切割DNA。被切割下来的片段扩散至上清液中，而剩余的大块染色质保留在磁珠固定的细胞内。

由于MNase是一种加工酶，所以必须终止反应，以防止释放的DNA片段被过度消化掉。pAG-MNase孵育后，加入含有EDTA和EGTA的Stop缓冲液以螯合游离钙离子并终止酶活性。短暂加热反应体系以降解RNA，并将剩余的染色质片段释放至溶液中。

 

步骤6：DNA纯化

因为细胞仍与磁性ConA珠结合在一起，所以CUT&RUN富集DNA的分离很简单。利用磁性，将含有大量染色质的磁珠偶联细胞与剪切下的目标DNA片段分离开，目标DNA被留在溶液中。目标DNA片段纯化后，通过荧光测定（例如ThermoFisher QubitTM）进行定量。

DNA产量一般不作为表明CUT&RUN成功的指标，相反，当目标是~5 ng DNA时，后续CUT&RUN文库制备的效率较高。由于原始的CUT&RUN DNA产量通常低于Bioanalyzer / TapeStation的检测极限，所以不建议使用这些方法在Bioanalyzer / TapeStation上分析原始的CUT&RUN DNA。

EpiCypher还检测了阳性对照和实验靶标高于IgG阴性对照反应的产量（即使只是略高）。根据概述的指标确认好DNA质量后，即可进行下一步的文库构建。

 

步骤7：CUT&RUN文库构建

将修复纯化的CUT&RUN DNA连接到测序adapter上，并进行PCR扩增以生成测序文库。PCR扩增使用了针对CUT&RUN低产量和小片段规格的优化参数，条形码引物用于实现多路测序。EpiCypher的Library Prep Kit经过专门优化，可以进一步简化您的工作流程。

在测序之前，确认CUT&RUN成功的最佳方法是对纯化文库进行片段大小分布的分析。使用毛细管电泳（例如Agilent Bioanalyzer或TapeStation）确认CUT&RUN文库的片段大小分布和浓度。由于MNase将片段消化到核小体水平的分辨率，所以平均峰值一般约为~300 bp（~170 bp的片段DNA+adapter）。有关确保测序文库质量的更多详细信息，请参阅该文。

 

步骤8：Illumina®下一代测序

文库以等摩尔比例汇集，并加载到所需的平台上进行测序。每个样本只需要300-800万次读取，就可以获得背景上的稳健信号（相比之下，ChIP-seq则需要超过2000万次读取），并且允许用户在单次运行中多路传输10-100个样本。

 

 

本文中所描述的技术为EpiCypher公司所属，均具有一项或多项专利。EpiCypher的注册商标和知识产权可见https://www.epicypher.com/intellectual-property/。本文中的所有其他商标和商品均为其各自公司所有。


本文翻译自链接https://support.epicypher.com/article/19-basic-steps-of-cut-run，如与原文有出入的地方，请以英文原文为准。

未经EpiCypher公司事先书面同意，本文件不得部分或全部复制。

 

关于EpiCypher公司：

EpiCypher是一家成立于2012年的表观遗传学公司。从专有组蛋白肽阵列平台EpiGold™开始，EpiCypher开发了一系列同类产品。同时，EpiCypher是重组核小体制造和开发的全球领导者。利用其独有技术，不断添加高纯度修饰重组核小体（dNucs™）产品。dNuc™多样性的产品为破译组蛋白编码和加速药物开发提供了强大的工具。

EpiCypher还将dNuc™技术广泛的应用于多种分析测定产品中，包括：SNAP-ChIP®Spike-in Controls（用于抗体分析和ChIP定量）， EpiDyne®底物（用于染色质重塑和抑制剂筛选及开发），dCyher™测定（用于探究表观遗传蛋白质-组蛋白PTM结合相互作用）。最近，EpiCypher还推出了针对ChIC、CUT&RUN和CUT&Tag的高灵敏度表观基因组图谱CUTANA™分析。

如需了解更多详细信息或相关产品，请联系EpiCypher中国代理商-上海金畔生物 

免疫荧光（IF）实验步骤

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免疫荧光（IF）实验步骤

免疫荧光（IF）实验步骤的一般流程：

1.用聚乙烯亚胺或多聚赖氨酸涂覆盖玻片，在室温下放置 1 小时。

2. 用无菌水充分漂洗盖玻片3 次，每次1 小时。

3. 充分干燥盖玻片，在紫外光下灭菌至少4 小时。

4. 使细胞在玻璃盖玻片上生长。

5. 用磷酸盐缓冲液(PBS) 简单漂洗。 推荐使用1 × PBS 0.1% Tween 20 作为洗涤缓冲液。

固定 

可使用以下两种方法中的一种固定细胞： 

1.室温下，在100% 甲醇（-20 ℃ 冷冻）中孵育细胞5 分钟。

2. 室温下，在4% 多聚甲醛（溶于 PBS 中，pH 7.4）中孵育细胞 10 分钟。 用冰PBS 洗涤细胞3 次。 

抗原修复（可选步骤） 

在抗原修复缓冲液对细胞进行加热处理后，有些抗体的效果会更好。查看产品信息，了解每种一抗的使用建议。

1. 将抗原修复缓冲液（100 mM Tris，5% [w/v] 尿素，pH 9.5）预热至 95 ℃。具体方法为：将装有缓冲液的盖玻片染色缸置于水浴锅中，水浴锅的温度设 为 95 ℃。

2. 用小型宽头镊子小心将盖玻片置于盖玻片染色缸内的抗原修复缓冲液中，记下长 有细胞的盖玻片面。 

3. 在 95 ℃ 下加热盖玻片10 分钟。 

4. 从抗原修复缓冲液中取出盖玻片，浸入 6 孔组织培养板内的PBS 溶液中，保持 长有细胞的一面朝上。 

5. 用 PBS 洗涤细胞3 次，每次5 分钟。 

通透 

1.如果靶蛋白位于细胞内，对细胞进行通透处理尤为关键。用甲醇固定的样品不需要进行 通透处理。 用PBS（含 0.1–0.25% Triton X-100 或 100 μM Digitonin 或 0.5% Saponin）孵育样品10 分钟。Triton X-100 是用于提高抗体渗透性最常用的 去垢剂。但 Triton X-100 会破坏细胞膜，因此不适用于细胞膜抗原。

2.确定每种目标蛋白的Triton X-100 最佳比例。

3.用 PBS 洗涤细胞3 次，每次5 分钟。 

封闭与免疫染色 

1.用 1% BSA、22.52 mg/mL 甘氨酸的PBST (PBS + 0.1% Tween 20) 孵育细 胞30 分钟，封闭抗体的非特异性结合（可替代的封闭液包括 1% 明胶或来源于产生 二抗的物种的10% 血清：查看抗体数据表了解相关建议）。

2.室温下，用稀释抗体（溶于 1% BSA 的PBST 中）在湿盒中孵育细胞1 小时， 或4 ℃ 过夜孵育。倒出溶液，用PBS 洗涤细胞3 次，每次5 分钟。

3.室温下，用二抗（溶于 1% BSA 中）避光孵育细胞1 小时。

4.倒出二抗溶液，用PBS 避光洗涤细胞3 次，每次5 分钟。

多色染色（可选步骤）

要检测同一个样品中两种或多种抗原的共同分布情况，需要使用双重免疫荧光流程。该流程可在混合物中同时进行检测，也可逐个抗原依次进行检测。 

确保抗体来源于不同物种并且这些抗体有相应的二抗。例如，抗抗原 A 的兔抗体和抗抗 原B 的鼠抗体。也可使用偶联至不同荧光团的直标一抗。

同时孵育

1. 用封闭液孵育细胞30 分钟。

2. 室温下，用两种一抗（溶于 1% BSA 的PBST 中）在湿盒中孵育细胞1 小 时，或4 ℃ 过夜孵育。

3. 倒出溶液，用PBS 洗涤细胞3 次，每次5 分钟。

4. 室温下，用两种二抗（溶于 1% BSA 中）避光孵育细胞1 小时。

5. 倒出二抗溶液，用PBS 避光洗涤细胞3 次，每次5 分钟。

依次孵育 

1. 第一封闭步骤：室温下，用第一封闭液（来源于产生二抗的物种的 10% 血 清）孵育细胞 30 分钟。

2. 室温下，用第一种一抗（溶于 1% BSA 或 1% 血清的PBST 中）在湿盒中孵 育细胞1 小时，或4 ℃ 过夜孵育（一抗溶于 1% 明胶或 1% BSA 的PBST 中）。

3. 倒出第一种一抗溶液，用PBS 洗涤细胞3 次，每次5 分钟。

4. 室温下，用第一种二抗（溶于 1% BSA 的PBST 中）避光孵育细胞1 小时。

5. 倒出第一种二抗溶液，用PBS 避光洗涤细胞3 次，每次5 分钟。

6. 第二封闭步骤：室温下，用第二种血清（来源于产生二抗的物种的 10% 血 清）避光孵育细胞30 分钟。

7. 室温下，用第二种一抗（溶于 1% BSA 或 1% 血清的PBST 中）在湿盒中避 光孵育细胞1 小时，或4 ℃ 过夜孵育。

8. 倒出第二种一抗溶液，用PBS 避光洗涤细胞3 次，每次5 分钟。

9. 室温下，用第二种二抗（溶于 1% BSA 中）避光孵育细胞1 小时。

倒出第二种二抗溶液，用PBS 避光洗涤细胞3 次，每次5 分钟。 

如需检测两种以上的抗原，其余抗体按照步骤1–5 继续操作

复染 

1.用 0.1-1 μg/mL Hoechst 或 DAPI（DNA 染色）孵育细胞 1 分钟。

2. 用 PBS 漂洗细胞。

封片 

1. 用一滴封片介质封闭盖玻片。 

2. 用指甲油密封盖玻片，避免样品变干和在显微镜下移动。 

3. -20 ℃ 或 4 ℃ 下避光保存。

更多详情请咨询上海金畔生物