细胞活性检测概述 (Determining Cell Vitality)
细胞活性(Cell Viability)是细胞生物学实验的一项重要检测指标, 是细胞培养、细胞毒性及生理研究的基础。Cayman提供多种细胞活性检测相关试剂盒, 可用于评估细胞增殖、细胞活性、代谢活性、细胞周期、细胞毒性和凋亡等。
细胞增殖检测, 确定活跃分裂细胞的数量, 最直接简单的方法就是细胞计数。细胞活性(Cell Viability)被定义为样品中健康活细胞的数量占总细胞的百分比, 确定样本中活细胞及死细胞的数量。同时, 检测DNA含量或代谢活性也可提供更多相关信息。
质膜完整性(Plasma Membrane Integrity)
评估细胞膜完整性是检测细胞活性和评估细胞毒性最常用和最直接的方法之一。具有细胞毒性效应的化合物通常会破坏细胞膜的完整性, 诱导细胞坏死。如碘化丙啶(Propidium iodide, PI)染料通常会被健康的细胞排除在外, 然而当细胞膜有破损时, PI则可自由跨过细胞膜而对细胞核染色。用PI染料可同时区分健康细胞和死细胞。同样, Cayman提供的7-AAD细胞活力检测试剂盒, 7-AAD不能进入活细胞但可透过死细胞或受损细胞膜, 而标记胞内DNA。
或者, 细胞膜完整性也可通过监测胞内物质释放到胞外基质来评估。一个最常用的检测指标就是乳酸脱氢酶LDH分子, 其为一种可溶性的胞浆酶。当胞膜损伤时, LDH可快速释放到细胞培养液中。Cayman提供的LDH细胞毒性检测试剂盒即可用于检测细胞坏死膜受损时, LDH的释放。
健康完整的细胞可经过固定、去垢剂破膜处理, 通过上述类似的标记方法来研究细胞周期进程。Cayman提供的细胞周期时相鉴定试剂盒利用碘化丙啶(PI), 来标记细胞周期不同时相的DNA。由于PI可直接嵌入DNA链的碱基对, 因此其荧光强度与细胞中DNA含量成正比。根据染色体的分布, 能可靠显示G0/G1 Vs S Vs G2/M期。此外, CFSE细胞分裂检测试剂盒采用一种荧光染料, 可扩散通过活细胞的质膜。CFSE在细胞分裂增殖过程中, 其荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减, 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中 , 因此其荧光强度是亲代细胞的一半 ,根据这一特性 ,CFSE可用于检测细胞增殖 , 细胞周期的估算及细胞分裂等。 7-AAD/CFSE细胞介导的细胞毒性检测试剂盒, 可用于鉴定增殖分裂的细胞, 同时标记受损或死细胞的DNA。最后, Cayman提供的 细胞自噬/细胞毒性双染色试剂盒利用自发荧光探针单丹磺酰尸胺(Monodansylcadaverine MDC)以及碘化丙啶(PI)可同时检测吞噬泡和死细胞。
线粒体活性与凋亡(Mitochondrial Activity and Apoptosis)
线粒体最主要的作用是产生ATP, 是细胞能量的主要来源。此外, 线粒体其他的作用还包括参与细胞信号传导、细胞分化、细胞死亡以及细胞周期调控和细胞生长等。检测线粒体的活性也可显示细胞的健康状态。
Cayman最近研发的一系列试剂盒(Mitocheck Activity Assay kits)用于检测电子传递链复合物I, II, III的活性(详情请阅读后续相关章节)。线粒体也可通过干扰电子传递、氧化磷酸化和ATP生成, 或通过释放能活化caspase家族蛋白酶的蛋白, 或改变胞内氧化还原电势等来诱导细胞凋亡 。 JC-1是 一 种 广 泛 用 于 检 测 线 粒 体 膜 电 位 的 理 想 荧 光 探 针 。
Cayman提供的JC-1 Mitochondiral Membrane Potential Assy能可靠检测细胞凋亡早期阶段的线粒体膜电位变化。Caspase-3 Fluorescence Assay通过鉴定特异性凋亡标志分子caspase-3的活化, 来检测线粒体诱发的凋亡。
此外, Cayman还提供多种试剂盒用于检测凋亡过程中不同时间点的形态变化。Annexin V-FITC试剂盒用于检测凋亡早期膜的不对称性变化。磷脂不对称性的分布于细胞质膜, 其中磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS) 主要分布于质膜内层。在细胞凋亡的早期, 虽然细胞膜仍保持完整性, 但磷脂分布的不对称性受干扰, 磷脂酰丝氨酸外翻, 暴露于细胞膜外层。
在Ca 2+ 存在时, Annexin V可与带负电荷的磷脂如PS结合。在细胞凋亡的晚期阶段, 可使用Cayman的Apoptotic Bleds Assay试剂盒进行检测, 该试剂盒利用重组的抗体, 与凋亡细胞膜泡上的自身抗原结合。Multi Parameter Apoptosis Assay kit联合使用4种不同的试剂, 同时检测多种凋亡事件。该独特的试剂盒利用FITC-Annexin V结合物作为探针检测质膜不对称性, 用TMRE作为探针检测线粒体膜电位, 用7-AAD作为膜通透性/细胞活力指示剂, 再用Hoechst染料展示细胞核形态。
代谢活性（Metabolic Activity）
细胞计数反映绝对细胞数的多少, 而代谢活性更多是对细胞健康状态的评估。将二者结合起来, 便可更全面具体的了解细胞的活性。例如, 在抗肿瘤药物研发中, 其目的可能不需致死细胞而仅需敲除其代谢和增殖活性, 使细胞维持在预期的静止状态。检测代谢活性的一个经典方法是利用四唑盐(Tetrazolium salts), 其在代谢活跃的细胞线粒体中, 被切割形成有色的不溶于水的MTT, 或水溶性的XTT, WST-1和WST-8甲臢(formazan), 然后再测定吸光度。产生的甲瓒染料的量与代谢活跃的细胞数量直接相关, 可显示细胞的还原电位。MTT法是细胞增殖检测最常规的方法, 久享盛誉, 具有大量的文献支持。但是，与一些新的四唑盐法相比, MTT法灵敏度较低。另一个缺点就是由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水, 需有机溶剂DMSO溶解后才能在分光光度计上读数, 增加了实验操作步骤。而XTT, WST-1和WST-8则产生水溶性的甲瓒产物, 省去了后续的溶解步骤。尤其, WST-8与其它四唑盐相比, 更稳定、细胞毒性更低, 适用于较长时间孵育, 而且WST-8检测灵敏度比其他四唑盐更高。Cayman提供的 ® Pertecta3D Cell Viability Kit适用于3D细胞培养, 是基于酶催化还原WST-1生成一种甲臢衍生物来进行检测的。与传统的放射性[3H]标记的胸腺嘧啶脱氧核苷或非放射性的 5-溴 -2′-脱氧尿苷 (Brdu)方法相比 , MTT,XTT, WST-1和WST-8具有操作简便的优点。
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