免疫组化故障排除指南（解决方案）
很多科研的小伙伴在做免疫组化实验时，可能会遇到一些奇奇怪怪的问题，本篇小欣整理了免疫组化故障排除指南，大家可以根据下列的免疫組化故障排除指南来快速找出问题原因，改善您的实验步骤和解决方案。
首先可以从下面几个情况中找到您的免疫荧光染色的问题所在：
一、染色较弱或无染色
可能存在的问题及解决方案：
一抗量不够：
增加抗体浓度
延长孵育时间
一抗二抗不兼容：
二抗应该是抗一抗宿主的。例如，如果一抗是小鼠来源的，那就需要用抗小鼠的二抗
亚型需要兼容
待测组织干透：
在整个染色过程中都需要使样品完全被覆盖于溶液中。
细胞没有通透：
用甲醇或者丙酮固定可以通透细胞
如果使用甲醛固定，用0.2% Triton X-100通透细胞
脱蜡不充分：
加长切片脱蜡时间
确保使用新鲜配制的二甲苯
一抗不适用：
确保抗体被验证过适用于对应类型的IHC, 福尔马林固定, 石蜡包埋, 新鲜冻存切片等等。
• 使用WB先检测抗体，确保抗体没有变质。
组织过度固定：
减少固定的时间
做抗原修复以显现抗原表位
孵育时间太短：
增加一抗和样品孵育的时间
切片储存问题：
样品染色后应该尽快观察，否则信号会随时间减弱。如需要的话，将切片保存在 4⁰C 黑暗处。
抗体储存问题：
反复冻融是对抗体不利的，可引起降解. 最好是在收到产品时将其分成多个小份来保存。
抗体没有按照建议的方式保存. 如果是这样的话可能需要重新购买一支。
如果二抗没有在黑暗处保存 (使用免疫荧光时), 应更换一支新的二抗。
蛋白没有在检测的组织中出现：
做一个阳性对照
如果目标蛋白显现但是信号不强, 增加一个扩大信号步骤
二、高背景染色
可能存在的问题及解决方案：
脱蜡不充分：
加长切片脱蜡时间
确保使用新制的二甲苯
内源的过氧化物酶活性：
如果使用的是HRP检测系统，在进行染色步骤前用3% H2O2 降低内源过氧化物酶活性
内源的生物素：
如果使用的是生物素检测系统，而样品中内源生物素水平又很高 (例如. 肾脏，肝脏，胰脏)，那么需要先使用抗生物素蛋白孵育样品来封闭内源生物素，再进行正常的封闭步骤，然后在一抗孵育前再用生物素封闭。
抗体浓度太高：
进一步稀释一抗/二抗
非特异性结合：
做一个没有一抗的二抗空白对照. 如果有染色，说明二抗有非特异性结合，更换一种二抗，或者使用标记一抗
封闭不充分：
增加封闭孵育时间或考虑更换封闭液。
信号放大过度：
减少信号放大孵育时间，稀释二抗
洗涤不充分：
步骤之间的适当洗涤非常重要. 确保遵循说明说上的洗涤步骤
组织切片太厚：
考虑使用更薄的切片，因为过厚的切片超过了共焦平面的部分会造成过度的背景染色
三、非特异性染色
抗体浓度过高：
降低抗体的浓度和孵育时间
一抗宿主与要染色的组织来源是同一物种 (例. 小鼠抗小鼠的一抗):
• 尝试使用来自不同物种的一抗。或者尝试用二抗宿主的血清来阻断内源的IgG 。或者用 1% Triton 孵育切片以清理组织。或者使用 TBS-Tween 20作为洗涤液而不是用 PBS-Tween 20。
如以上内容未能解决您的需求，可联系我们上海金畔生物相关技术同事，帮您解疑答惑。
