免疫印迹实验操作指南

该免疫印迹实验方法仅供参考，由于每个实验使用的试剂不同，并且涉及不同的物种，组织类型及实验应用，实验人员设计应根据具体情况设计实验步骤和改良。

阻断

1.使用 5% 脱脂奶粉溶于 1X TBST 作为阻断缓冲液.

2.使用足够多的阻断缓冲液确保凝胶被完全覆盖.

3.室温下阻断并震荡1小时.

冲洗

1.1X TBST 中冲洗3次，每次4分钟，然后1X TBS中冲洗 3次，每次4分钟.

2.确保在盒子里一直都有足够的冲洗缓冲液.

一抗孵育

1.将一抗在 TBST中稀释.

2.室温下震荡孵育 2 小时.

3.时而检查凝胶确认其完全被抗体溶液覆盖.

冲洗

1.1X TBST 中冲洗3次，每次4分钟，然后1X TBS中冲洗 3次，每次4分钟.

2.确保在盒子里一直都有足够的冲洗缓冲液.

二抗孵育

1.在1X TBST (浓度根据使用的抗体而定) 中制备二抗.

2.室温下震荡孵育 1 小时.

3.时而检查凝胶确认其完全被抗体溶液覆盖.

冲洗

1.1X TBST 中冲洗3次，每次4分钟，然后1X TBS中冲洗 3次，每次4分钟.

2.确保在盒子里一直都有足够的冲洗缓冲液.

检测

ECL检测试剂的用量取决于凝胶的大小. 通常来说, 用量需要足够完全覆盖凝胶.

1.1:1 混合溶液 A 和溶液 B.

2.用镊子夹起凝胶，轻轻拍在无尘擦纸上，去除凝胶上多余的 Tris.

3.把凝胶放在新的干净的盒子里，加入检测试剂，确保凝胶均匀的被覆盖.

4.在黑暗中孵育凝胶 5 分钟.

5.用镊子夹起凝胶，用无尘擦纸洗掉多余的试剂.

6.凝胶成像.

如需购买相关产品，请联系上海金畔生物

免疫组化实验操作指南

该免疫組化实验方法仅供参考，由于每个实验使用的试剂不同，并且涉及不同的物种，组织类型及实验应用，实验人员设计应根据具体情况设计实验步骤和改良。

所需试剂

• 丙酮

• 乙醇，无水变性的，组织学分级 (100% 和 95%)

• 蒸馏水

• 苏木精

• 二甲苯

• 10X TBS: 制备 1 升10X TBS：24.2g Tris base, 80g NaCl; 用HCl (使用 1X) 将pH 调至 7.6 。

• 洗涤液 TBS/T: 1X TBS, 0.1% Tween-20: 制备 1 升需将100ml 的 10x TBS 加入到 900 ml 双蒸馏水中。加入1ml Tween 20 然后混合。

• 10 mM 柠檬酸钠缓冲液： 制备 1 升需将 2.94g 柠檬酸钠加入到 1 升的蒸馏水中。将 pH 调至 6.0。

• 3% 过氧化氢： 制备需将10ml 30% H₂O₂ 加入到 90ml 蒸馏水中。

• 封闭液: 5% 马血清或山羊血清溶于TBS

• ABC 试剂: 在使用前30分钟根据制造商说明制备。

• DAB 试剂: 根据制造商说明制备。

组织制备

A. 新鲜冷冻切片

组织制备

1. 在液氮中将组织切成小块 (5 mm x 5 mm x 3 mm)。

2. 转移到恒冷箱切片机中, 切成5–30 μm薄的切片，将切片转移至带正电荷的载玻片上 (poly-L-lysine 包被的).

3. 室温下干燥切片 (若当天染色则干燥1-2 小时，直至完全干燥)。注意：彻底干燥才能保证组织恰当地粘附在切片上。

固定方法

可用的固定方法有很多种. 应遵循产品说明书上指定的方法或找到适宜样品的最佳方案。

• 冷丙酮: -20°C处理10分钟。自然干燥。

• 甲醇: -20°C处理10分钟。

• 10% 中性甲醛溶液: 室温下10分钟。

• 3% 甲醛: 室温下15分钟。

• 3% 甲醛/甲醇: 室温下15分钟，然后用甲醇 -20°C处理 5 分钟 (中间不要漂洗)。

用PBS （pH 7.4 含1% Tween 20）漂洗切片3次，每次5分钟。

B. 固定的, 冷冻组织切片

1. 使组织充满固定剂或将组织浸入到固定剂中一段时间。最常用的固定剂是4% 多聚甲醛。

2. 将组织浸没于冻存保护液（其中含有含10-30%蔗糖的PBS）中。当组织沉入溶液中后冻存保护就完成了。

3. 从冻存保护液中取出组织，保存于 -70°C 直到切片。

4. 将组织从 -70°C 冰箱取出，在-20°C平衡15分钟 然后再切片。-20°C平衡帮助避免切片时的断裂。

5. 用恒冷箱切片机将组织切成 10-15um 的切片，收集切片置于载玻片上。通常每个载玻片可以放置3片切片，留出足够间距。

6. 充分干燥切片。可使用自然风干或切片加热器，通常需要过夜或在40-50°C下至少干燥2~3小时。

7. 制好的切片可以干燥保存在 -70°C 直至染色。 在复水染色前要先平衡至室温并适当干燥。

C. 石蜡包埋切片

脱蜡和水化切片

1. 二甲苯：换 2-3 次，每次5分钟。

2. 100% 纯乙醇：换2次，每次3分钟。

3. 95% 乙醇: 换2次，每次3分钟。

4. 80% 乙醇：3分钟。

5. 50% 乙醇：3分钟。

6. 蒸馏水，PBS，或 Tris buffer：换2次，每次3分钟。

注意: 一旦组织切片复水，不要使之干透。用吸水纸吸干组织切片周围。用钻石划针，免疫組化笔，陶瓷记号笔, 或指甲油在载玻片上将切片圈起来。这个圈可以在接下来的孵育过程中使溶液留存于切片上。

抗原修复

很多抗原的可视性可以通过抗原修复来提高，抗原修复可以打破福尔马林固定时形成的蛋白质交联，从而使被掩藏的抗原显现出来。抗原修复技术包括不同时间长度的加热或者利用蛋白酶来做酶消化，例如蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。

加热的方法通常会用到微波炉，高压锅，蒸箱或水浴。将样品在接近100°C高温加热20分钟后再冷却同等的时间。最常用的抗原修复液有 a) 柠檬酸盐缓冲剂, pH 6.0, b) Tris-EDTA, pH 9.0 和 c) EDTA, pH 8.0.

如需要可用柠檬酸盐缓冲剂做抗原修复：

柠檬酸盐缓冲剂配方:

• 10mM 柠檬酸钠, 0.05% Tween-20, pH 6.0 或

• 10mM 柠檬酸, 0.05% Tween-20, pH 6.0

1. 将含有柠檬酸钠或柠檬酸盐缓冲剂的染色盘放到蒸箱或者水浴中，预热到95-100 °C。

2. 将切片浸没于染色盘中。盖子虚掩，孵育20-40 分钟 (研究者需自己决定最佳的孵育时间)。

3. 关掉蒸箱或水浴，将染色盘置于室温下，让切片冷却20分钟。

4. 在TBS-Tween-20中漂洗切片2次，每次2分钟。

5. 开始封闭步骤。

过氧化氢孵育

阻断内源性过氧化物酶 (如需要):

1.将切片浸入到 0.3-3% H2O2 和 100% 甲醇中，室温下10-30 分钟。

2.在蒸馏水中漂洗切片，换2次，每次5分钟。

免疫组化实验方案

封闭步骤:

1. 用3-10% 来自二抗宿主物种的正常血清孵育切片30分钟，以阻断非特异的抗体结合。

2. 移去封闭液。

一抗孵育

*所有步骤需在湿润的环境中进行。

1. 在封闭液中稀释一抗。如果没有建议的稀释度，从 1:10, 1:100 和 1:1000开始。

2. 4°C 孵育过夜。

3. 移去抗体溶液。用PBS，pH 7.4 洗涤3次，每次5分钟。

4. 如果一抗是HRP-标记的，直接开始显色步骤。

二抗孵育

1. 根据建议的稀释度在封闭液中稀释生物素–标记的二抗。室温下孵育 30-60 分钟。

2. 移去二抗溶液。在洗涤液中清洗3次，每次5分钟。

显色

1. 向每个切片中加入链霉亲和素–辣根过氧化物酶试剂，室温下孵育30分钟。

2. 移去 ABC 试剂。用洗涤液清洗切片3次，每次5分钟。

3. 在湿润的环境下用 DAB 溶液彻底覆盖切片。室温下孵育 5-15 分钟。或者，在显微镜下观察切片来决定最佳的不溶沉淀物颜色深度。

4. 一旦显色，用蒸馏水小心冲洗以终止反应。

5. 如需要可以用苏木精和曙红对组织进行复染色。

6. 用蒸馏水清洗切片。

复水以及加盖玻片

1. 样品复水：使用一系列不同浓度的甲醇或乙醇– 50% (2 x 5 min), 75% (2 x 5 min), 最后 100% (2 x 5 min)。

2. 用二甲苯重复上述步骤，孵育切片两次，每次10秒钟。

3. 使切片自然干燥。

4. 用合适的固定介质固定好盖玻片。

更多详情请咨询上海金畔生物~

免疫荧光实验操作指南

该免疫荧光实验方法仅供参考，由于每个实验使用的试剂不同，并且涉及不同的物种，组织类型及实验应用，实验人员设计应根据具体情况设计实验步骤和改良。

-切片制备

A. 细胞涂片

将培养的细胞生长于无菌的盖玻片或载破片上，37℃过夜孵育。

用PBS简单洗涤。

按需固定. 可用的步骤有:

含10% 福尔马林的PBS 固定10分钟 (保持湿润).

冰冷的甲醇固定5分钟，自然干燥。

冰冷的丙酮固定5分钟，自然干燥。

用PBS冲洗。

B. 冷冻组织切片

在液氮或用液氮预冷的异戊烷中切割冷冻的新鲜组织， 放置于含有OCT冻存液的cryomolds被膜中. 速冻后保存在 – 80 ?C。

用恒冷箱切片机将组织切成4-8 um 厚的切片，然后固定在急冻切片或明胶包被过的切片。使用前将切片保存于 – 80℃。

染色之前，将切片置于室温下 30分钟然后于冰冷的丙酮中固定5分钟。自然干燥30分钟。

在PBS中漂洗。

C. 石蜡组织切片

将切片在二甲苯中去石蜡两次，每次5min.

使用100% 乙醇水化两次，每次3min.

使用95%乙醇水化 1min.

蒸馏水漂洗.

按需根据预制备步骤操作.

-组织切片预制备

*对于非石蜡包埋的冷冻切片和培养细胞，请不要使用该预制备步骤。

被福尔马林固定和石蜡包埋封闭的抗原决定簇可以使用抗原修复剂、酶消化或肥皂精等来使之显示。

-步骤

在PBS-Tween 20 中漂洗切片两次，每次2分钟。

血清封闭: 用正常血清封闭孵育切片 – 物种来源应与二抗相同, 孵育30分钟来封闭非特异的免疫球蛋白结合。 注意：由于该实验使用的 avidin-biotin 检测系统, 根据组织类型不同，可能需要avidin/biotin 封闭，avidin/biotin 封闭应在正常血清封闭之后。

一抗: 在一抗溶液中孵育切片，室温下1小时或4℃过夜。

在PBS-Tween 20中漂洗。

二抗： 在生物素化二抗溶液中孵育切片，室温下30分钟。

用PBS-Tween 20 漂洗三次，每次2分钟。

检测: 在含FITC-Avidin D 的PBS溶液中孵育切片，室温下30分钟。从该步骤开始要确保切片避光，直到最后将切片用铝箔纸包裹或放进避光盒子中。

用PBS-Tween 20 漂洗三次，每次2分钟。

如需要，用PI 或 DAPI 复染色。

在PBS-Tween 20中漂洗。

用95% 乙醇脱水 2 分钟, 100% 乙醇脱水两次，每次3分钟。

用抗褪色固定介质覆盖切片。

如需了解更多免疫荧光实验操作问题及免疫荧光相关产品，请联系上海金畔生物~

免疫沉淀实验操作指南

该免疫沉淀实验方法仅供参考，由于每个实验使用的试剂不同，并且涉及不同的物种，组织类型及实验应用，实验人员设计应根据具体情况设计实验步骤和改良。

所需试剂

细胞准备:

•Tris 缓冲盐溶液（TBS）. 使用 10x TBS, pH 7.5 (1.0M Tris HCl, 1.5M NaCl). 用适量去离子水稀释到 可在室温下保存一个月 .

•裂解缓冲液. 含有0% 合适洗涤剂的TBS、1mg/ml的 牛血清白蛋白 BSA、合适的蛋白质酶抑制剂.

•稀释缓冲液. 与裂解缓冲液相同, 除去蛋白质酶抑制剂.

•用于裂解物预处理的琼脂糖轭合物. 预吸收裂解物以移除与一抗二抗的非特异结合. 用来自同一物种的琼脂糖标准 IgG做一抗, 抗宿主的二抗. 用稀释缓冲液1:1制备悬浮液.

一抗:

•一抗的对照. 对于多抗血清, 使用来自同一物种的未免疫的血清. 单克隆抗体使用相同亚型和纯度.

•免疫沉淀的琼脂糖轭合物. 使用抗一抗宿主的琼脂糖二抗. 用稀释缓冲液1:1制备悬浮液.

•Tris 缓冲液. 制备05M 的Tris 缓冲液, pH 6.8.

•2x SDS-PAGE 样品缓冲液

•2-巯基乙醇

实验步骤

1.将5 x 107 细胞置于裂解缓冲液中, 在冰上孵育30-60 分钟制备裂解液.

2.涡旋裂解液后置于离心机上250 x g离心10分钟, 除去细胞核留下上清液.

3.将上清液于100,000 x g离心30分钟, 或者微型离心机10,000 x g 离心30分钟, 再取上清液.

4.加入琼脂糖轭合物来预处理裂解液以除去非特异的蛋白结合. 每200 µl 裂解液使用10µl 对照琼脂糖. 于4ºC下震荡1小时. 200 x g离心. 留上清液.

5.向两个微离心管中各加入 200 µl 含有抗原的预处理了的裂解液. 用稀释缓冲液将体积补至 1 ml.

6.向一个离心管中加入一抗. 对于多克隆抗血清或腹水加入5-5 µl一抗. 对组织培养上清液加入 10-100 µl一抗. 向第二个离心管加入同等体积的一抗对照. 冰上孵育1小时.

7.做免疫沉淀时每个管加入50µl琼脂糖轭合物. 4ºC下轻微震荡1小时.

8.于200 x g离心1分钟或微型离心机离心5秒钟. 用移液管小心移出上清液. 用1 ml 稀释缓冲液轻缓重新悬浮底部团块. 重复洗涤. 先用TBS洗涤最后用5 M Tris, pH 6.8洗涤.

9.如上所示再次离心. 加入20-50 µl 样品缓冲液. 混合后在100 ºC加热5分钟. 稍微微离心一下, 将上清液直接用于非还原性电泳SDS-PAGE. 如果需用还原性条件, 将上清液转移到新管中加入5% 2-巯基乙醇. 如上混合加热.

10.电泳蛋白质混合物. 染色凝胶或免疫印迹 (使用我们 Western Blot 的实验方案) 显色. 显现的条带包括抗原的多肽链和使用的抗体.

* 怎样选择正确的珠子:

物种免疫球蛋白亚型Protein AProtein G

人 IgG1  结合力强        结合力强

人 IgG2  结合力强        结合力强

人 IgG3  没有结合力      结合力强

人 IgG4  结合力强        结合力强

人 IgM  使用抗 人 IgM

人 IgE  没有结合力      结合力弱

人 IgA  没有结合力      结合力弱

小鼠 IgG1  结合力弱        结合力强

小鼠 IgG2a  结合力强        结合力强

小鼠 IgG2b  结合力中等     结合力中等

小鼠 IgG3   结合力弱        结合力弱

小鼠 IgM   使用抗小鼠 IgM

大鼠 IgG    没有结合力    结合力弱

大鼠 IgG2a    没有结合力    结合力强

大鼠 IgG2b    没有结合力    结合力中等

大鼠 IgG2c    结合力弱        结合力中等

鸡的 所有亚型  没有结合力   没有结合力

牛的所有亚型结合力中等   结合力强

山羊的所有亚型没有结合力   结合力中等

豚鼠所有亚型结合力强   结合力中等

仓鼠所有亚型结合力弱   结合力中等

马的所有亚型结合力弱   结合力强

猪的所有亚型结合力弱   结合力中等

兔的所有亚型结合力强   结合力中等

绵羊的所有亚型没有结合力   结合力强

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