StressMarq——Alpha 突触核蛋白产品推荐（2）

StressMarq——Alpha 突触核蛋白产品推荐（2）

来源: Cellstate Biosciences

来源: Verma et al., https://doi.org/10.1523/ENEURO.0134-20.2020  

1型小鼠PFFs 诱发原代多巴胺能神经元中的Alpha突触核蛋白聚集

研究人员使用 StressMarq 的小鼠 PFF（目录号 SPR-324）来证明特定的 CBP/p300 抑制剂可以减弱alpha 突触核蛋白聚集

来源：Hlushchuk et al. https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acschemneuro.1c00215

1型 PFFs 诱发大鼠脑中的 pSer129 病理现象

StressMarq 的小鼠 α 突触核蛋白 PFF（目录号 SPR-324）可在30天内诱发从注射部位扩散的病理学

将 16 µg 小鼠 α-syn 1 型原纤维（目录号 SPR-324）注射到 Sprague-Dawley 大鼠纹状体一侧的两个位点。30 天后，提取大脑并进行 pSer129 固定和染色。在皮层的同侧（顶部）和对侧（底部）部分可以看到 PD 样病理的扩散。

注: performed by Atuka Inc., Toronto

PFFs（目录号 SPR-324）两位点双边纹状体内注射至大鼠大脑，图像显示纹状体

来源: performed by Atuka Inc., Toronto

将 PFF（目录号 SPR-324）通过两个位点双边纹状体注射至大鼠大脑，图像显示扣带皮层

来源: performed by Atuka Inc., Toronto

将PFF（目录号 SPR-324）从两位点双边纹状体内注射大鼠大脑后，纹状体中多巴胺和多巴胺代谢物的水平

来源: performed by Atuka Inc., Toronto

1型 PFFs 诱发小鼠脑中的 pSer129 病理现象
8 周大的C57/BL6 小鼠注射了超声处理的重组小鼠alpha突触核蛋白单体（目录号 SPR-323）或PFFs (目录号 SPR-324)。小鼠背侧纹状体单侧注射 (bregma AP + 0.2 mm，L +/- 2.0 mm, V – 3.0 mm) 并于注射30天后取脑切片。注射了PFF 的小鼠显示在注射位点对侧纹状体和皮质都有典型的PD pSer129 病理现象。
(A) 1.25 uL 小鼠alpha 突触核蛋白单体 (SPR-323). (B) 2.5 uL 小鼠alpha 突触核蛋白单体 (SPR-323). (C) 2.5 ug alpha 突触核蛋白 PFFs (SPR-324). (D) 5 ug alpha 突触核蛋白 PFFs (SPR-324). 内嵌图: PBS (阴性对照)	(A) 对侧皮质. (B) 同侧皮质. (C) 对侧纹状体. (D) 同侧纹状体.

来源: Porsolt, France

来源: KU Leuven, Belgium

1型 PFFs 诱发57BL/6 小鼠中的神经炎症

注射后4个月时检测 C57BL/6 小鼠大脑注射纹状体中的 GFAP+ 星形胶质细胞

来源: KU Leuven, Belgium

1型 PFF被SH-SY5Y 细胞吸收后在14天内转移到了神经元iPSC中

Alpha 突触核蛋白 PFF 信号（目录号 SPR-322，红色）与 iPSC（洋红色）信号相关，表明来自 SH-SY5Y 细胞（绿色）的 PFF 已转移。

来源: Neuronal cultures and ICC performed by Cellstate Biosciences (USA)

2型单体用于脑脊液聚集检测

2 型单体（目录号 SPR-316）聚集检测可区分患病样品和正常样品。

来源：RT-QuIC assay by Dr. Alison Green and Graham Fairfoul (Green Lab), University of Edinburgh, UK

2型 PFF 影响 SH-SY5Y 成神经细胞瘤细胞膜

美国加州州立大学的研究人员研究了2型α突触核蛋白PFFs（目录号SPR-317）暴露对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞膜的影响。将不同浓度的α突触核蛋白PFFS添加到神经母细胞瘤细胞中48小时。 使用扫描离子电导显微镜对α 突触核蛋白 PFF 与细胞膜的相互作用进行表征。 ● SICM 图像表明，随着原纤维浓度的增加，膜粗糙度显著增加。 ● 48小时内，PFF继续在细胞膜上积累 ● XTT 细胞活力和 LDH 细胞毒性测定表明 PFF 没有诱导大量细胞死亡 ● Alpha 突触核蛋白 PFFs 影响细胞膜并破坏细胞功能

PFF（目录号 SPR-317）处理 48 小时后 SH-SY5Y 细胞膜的代表性 SICM 图像。

来源: Feng et al. https://doi.org/10.1021/acschemneuro.2c00478

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StressMarq——Alpha 突触核蛋白产品推荐（1）

 StressMarq——Alpha 突触核蛋白产品推荐（1）

* 由于操作不同可能含有少量的不溶纤维。

Alpha 突触核蛋白产品类型：PFF

不同类型蛋白看起来形态相似, 但是特性不同

来源: 

1型原纤维(左上) 和纤丝(右下) 的EM来自加拿大维多利亚大学。

2型原纤维 (右上) 和A53T 突变型原纤维 (左下) 的EM 来自加拿大英属哥伦比亚大学。

Alpha 突触核蛋白产品类型: PFFs

StressMarq提供人、小鼠和大鼠Alpha 突触核蛋白PFFs

原纤维在浴式超声仪 (QSonica) 中以 80% 振幅进行超声处理（开启 30 秒，关闭 30 秒，10°C 下 30 个循环）。原纤维用乙酸双氧铀进行负染色，并在加拿大多伦多大学的 Talos L120C 透射电子显微镜中观察。

来源：Atuka Inc.。

硫磺素 T 聚集测试

单体浓度: 100 µM；原纤维浓度: 10 µM

来源：StressMarq Biosciences 内部数据

单克隆抗体选择性靶向病理性人 Alpha 突触核蛋白PFFs

不列颠哥伦比亚大学的研究人员使用 StressMarq 的 Alpha 突触核蛋白原纤维（目录号 SPR-322）通过计算设计了一种小环肽，该肽表现出与原纤维相同的神经毒性和聚集活性。他们通过肽支架免疫产生了有高度选择性的单克隆抗体，能够抑制α突触核蛋白原纤维的致病作用。这项研究可能在α突触核蛋白靶向治疗突触核蛋白病方面具有重要应用。

mAb 抑制 PFF 摄取和细胞内聚集体形成。将原代大鼠海马神经元培养物暴露于超声处理的人 PFF（目录号 SPR-322，1 μg/mL）中，不含或含 mAb（0.05 μM，PMN09 是0.25 μM）。 14天后染色处理，神经元标记物MAP2 (绿色), 人 α-syn 聚集体（红色）和细胞核（蓝色）染色。

mAb 抑制 PFF 聚集活性。在单独添加 α-syn 单体 (100 mM) 后或在超声处理的人 PFF (10 nM) 作为引种剂的情况下，不添加或添加 mAb (0.1 nM)，每小时用 ThT 荧光测定（每次读数前摇动 30 秒）跟踪聚集情况。

来源：Gibbs, E. et al. https://doi.org/10.3390/biomedicines10092168

帕金森样病理学在初级神经元中的诱发

超声处理的 1 型 α-突触核蛋白原纤维 (4 µg/ml) 诱导原代大鼠神经元中丝氨酸 129 的磷酸化，这是在 PD 中观察到的典型修饰现象。

孵育 14 天后进行 p-Ser129 染色：

◆ 1型原纤维在14天内诱发原代大鼠神经元中的帕金森样病理学

◆ 2型原纤维没有这个现象

来源: Associate Professor Rehana Leak, Duquesne University, USA

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StressMarq——Alpha 突触核蛋白产品推荐（3）

StressMarq——Alpha 突触核蛋白产品推荐（3）

Alpha 突触核蛋白A53T 突变型PFF

Alpha 突触核蛋白 A53T PFFs (目录号 SPR-326) 在培养的原代大鼠神经元中诱导丝氨酸 129 磷酸化

培养基中 1 µg/ml 超声处理的 StressMarq’s Alpha 突触核蛋白 A53T 突变 PFF（目录号 SPR-326）可诱导原代大鼠神经元中 Ser129 磷酸化。

来源: Associate Professor Rehana Leak,Duquesne University, USA

Alpha 突触核蛋白寡聚体
与不溶性原纤维相比，寡聚体是小的（25-30 nm）球状可溶结构。它们是与帕金森病相关的有毒聚集体，在结构上与原纤维不同。 负染色（铀酰酸）的电子显微镜图显示了Alpha 突触核蛋白的寡聚体结构，左侧为用多巴胺处理的alpha 突触核蛋白寡聚体 (目录号 SPR-466)，中间为EGCG处理的 (目录号 SPR-469) ，右侧为动态学稳定的寡聚体 (目录号 SPR-484).
来源: EM performed at U. of British Columbia	来源: EM performed at U. of British Columbia	来源: EM performed at University of Toront

Alpha 突触核蛋白毒性
100 µg/ml 的各种 α-突触核蛋白对原代小鼠皮质神经元的毒性测试，一式四份： 孵育 24 小时后进行 MTT 测定（左）和 LDH 释放测定（右）。
	寡聚体诱发的神经元毒性明显高于原纤维

来源: performed at QPS Austria GmbH

ATTO 594 标记的原纤维也有聚集活

ATTO594 标记的 (目录号 SPR-322-A594) 人 1型 Alpha 突触核蛋白PFF

ATTO 594 标记不会显著影响目录号 SPR-322 的聚集能力

ATTO 594 PFF 诱发人神经元中的病理现象

神经元培养试剂盒: 预分化的混合神经元 (血细胞iPSC;) 每孔4000个细胞。

细胞染色: 上: pSer129 α –syn 染色 (Alpha 突触核蛋白抗体, StressMarq 目录号 SMC-600), 绿色 中: ATTO 594 染色, 红色 下: 以上两者复合图, 外加肌动蛋白 (粉色) 和DNA (蓝色) 染色. 来源: ICC human iPSCs; CellState Biosciences, USA

与 Cellectricon (瑞典) 的合作项目

ATTO 标记的 PFF（目录号 SPR-322-A594）被引入微流控系统的第 1 室

荧光标记的 α 突触核蛋白原纤维 (目录号 SPR-322-A594) 被第 1 室的神经元摄取，并转运到第 2 室的细胞体中，诱导 α 突触核蛋白磷酸化。

ATTO-594 PFF 诱导大鼠肠神经元中Alpha 突触核蛋白聚集

Northeastern大学的研究人员使用 StressMarq 的 ATTO 594 标记的 Alpha 突触核蛋白 PFF（目录号 SPR-322-A594）来研究不同剂量下大鼠肠神经元对荧光标记的 PFF的吸收和保留。将前体原纤维 PD 模型应用于丁酸盐和脂多糖的共同给药组，以模拟局部肠道微生物组的影响。 ● 大鼠肠道和皮质神经元中 PFF 的摄取和保留具有显著的剂量依赖性 ● 加入了PFF 的肠神经系统 (ENS) 培养物的生长锥形态发生变化 ●  ENS 克服了 PFF 剂量以保持稳定的活性

(A) 理论上的前体原纤维 (PFF) 毒性进展的图示，从 PFF 的引入到神经元的摄取以及内源 α-突触核蛋白 (a-Syn) 的进一步聚集。 (B) 实验设计的时间表。 在整个实验期间，每 2-3 天喂养一次培养物。 (C) 为实验分离出来的神经元群（皮质和肠）的代表性图像，方框圈出的对应的解剖位置。

来源: Bindas et al. https://doi.org/10.1038/s41598-022-26543-x

动态学稳定的Alpha 突触核蛋白寡聚体
动态学稳定的alpha-突触核蛋白寡聚体的电镜图 (目录号 SPR-484)	(B)和(C)分别是冻融一次后的和37℃孵育两周后的尺寸排阻色谱(SEC)。在峰值处，90%SPR-484在冻融后37℃下孵育两周仍然稳定于寡聚体状态。
动态学稳定的 Alpha 突触核蛋白寡聚体 (目录号 SPR-484) 稳定于球状的寡聚体结构。
用对照 PBS 缓冲液处理后 11 天的原代大鼠多巴胺能神经元（左）和用 10 µg/mL 目录号 SPR-484 处理 11 天后的原代大鼠多巴胺能神经元（右）。细胞核呈蓝色 (Hoechst)，多巴胺能神经元呈红色 (MAP2)，病理现象呈绿色 (α-syn pSer129)。白色箭头指出的是 MAP2 阳性神经元中有明显 pSer129 病理现象的几个区域。
动态学稳定的Alpha突触核蛋白寡聚体 (目录号 SPR-484) 诱发原代大鼠多巴胺能神经元中的pSer129 病理现象

使用α 突触核蛋白单体、PFF 和 动态学稳定的寡聚体 开发的一种新型检测方法

爱丁堡大学的研究人员与 StressMarq Biosciences 合作，使用 α 突触核蛋白单体（目录# SPR-321）、PFF（目录# SPR-322）和动态学稳定的寡聚体（目录# SPR-484）开发了一种定量和表征聚集体的测定方法。这种新技术称为单分子双色聚集体下拉 ( STAPull )，可能是早期诊断中很有前景的工具，因为它能够检测皮摩尔级的寡聚体 α 突触核蛋白，与单色检测相比，灵敏度提高三倍。 ● 当两种正交标记的检测抗体靶向相同的表位时检测到寡聚体，从而导致双色共定位。 α突触核蛋白单体产生单色信号。 ● 这种新颖的方法可检测到动态学稳定的寡聚体（目录# SPR-484），这些寡聚体最有可能存在于帕金森病的最早阶段。

STAPull检测ThT阴性α- syn 寡聚体。 A) StressMarq 的人源重组 α-syn 的代表性SiMPull图像，其呈单体、动态学稳定的寡聚体或前体原纤维形式，如图所示。ThT 检测（顶部）或STAPull双色重合（底部）呈现的是相同的视野，插图是方框区域被放大。全视野比例尺为5 μm，插图为2 μm。 B) ThT 斑点平均数的量化，C) (A) 中表示的数据集的每平方微米STAPull重合事件。 参考文献： Saleeb ，R. 等人。 DOI： 10.1126/sciadv.adi7359

Tau-352 (胚胎 0N3R) & Alpha 突触核蛋白共聚集体原纤维
Tau-352 和 Alpha 突触核蛋白共聚体原纤维 （目录号 SPR-494）的电镜	胚胎 Tau-352 0N3R & Alpha 突触核蛋白共聚集体原纤维的体外聚集硫磺素T检测
来源: University of Toronto, Canada	来源: StressMarq Lab; internal results
StressMarq 的共聚体原纤维是将单体共孵育在一起之后形成的原纤维，所以该原纤维在单个原纤维中同时含有 Tau 和 Alpha 突触核蛋白。 Tau 0N3R 和 Alpha 突触核蛋白共聚集体原纤维 (目录号 SPR-494) 在72小时内既可以聚集 Alpha 突触核蛋白单体，也可以聚集Alpha 突触核蛋白和 Tau 0N3R 混合的单体。

Tau-441 (2N4R) & Alpha 突触核蛋白共聚集体原纤维
Tau-441 和 Alpha 突触核蛋白共聚集体原纤维 (目录号 SPR-495) 的电镜图	Tau 2N4R & Alpha 突触核蛋白共聚集体原纤维的体外聚集硫磺素T检
来源: University of Toronto, Canada	来源: StressMarq Lab; internal results
StressMarq 的共聚体原纤维是将单体共孵育在一起之后形成的原纤维，所以该原纤维在单个原纤维中同时含有 Tau 和 Alpha 突触核蛋白。 Tau 2N4R 和 Alpha 突触核蛋白共聚集体原纤维 (目录号 SPR-495) 在72小时内既可以聚集 Alpha 突触核蛋白单体，也可以聚集Alpha 突触核蛋白和 Tau 2N4R 混合的单体。

Tau & Alpha 突触核蛋白共聚集体原纤维的免疫-TEM

原纤维被吸附到碳涂层铜网格上。 6nm（asyn）和 12nm（tau）信号同时出现在共聚集体原纤维样品的同一原纤维链中(目录号 SPR-494, SPR-495)，并且在对照 α-突触核蛋白或 tau 原纤维中未观察到抗体交叉反应。

网格用含1% BSA 和 0.1% Tween-20 的 PBS 封闭，洗涤，然后依次在封闭缓冲液中用 20 µg/mL 的一抗孵育，洗涤，再在封闭缓冲液中用 20 µg/mL 的二抗孵育，洗涤并用2% 乙酸双氧铀作为负染色。 一抗: 小鼠抗人asyn单克隆抗体（StressMarq SMC-532）和兔抗人tau多克隆抗体（StressMarq SPC-802）;  二抗: 6nm 胶体金标记的山羊抗小鼠抗体 (Jackson ImmunoResearch 115-195-146) 和 12nm 胶体金标记的山羊抗兔抗体 (Jackson ImmunoResearch 115-195-146)。

StressMarq Alpha 突触核蛋白发表文献

人 Alpha 突触核蛋白前体原纤维 (1型)，目录号 SPR-322

Deciphering the role of hsp110 chaperones in diseases of protein misfolding. Yakubu, U. M. (2021) PhD Thesis, University of Texas.

2. Suppression of aggregate and amyloid formation by a novel intrinsically disordered region in metazoan Hsp110 chaperones. Yakubu, U.M. Morano, K.A. (2021) J Biol Chem Jan-Jun 2021;296:100567.

3. Design, Synthesis and Chemically Engineered Graphene Quantum Dot Applications: Contrast Agent for MR Imaging and Targeted Therapeutics on Parkinson’s Treatment. Poonkuzhali, K. et al. (2022) SSRN 4056733.

4. Rational Generation of Monoclonal Antibodies Selective for Pathogenic Forms of Alpha-Synuclein. Gibbs, E. et al. (2022) Biomedicines 10,2168. 

5. LRP1 is a neuronal receptor for α-synuclein uptake and spread. Chen, K. et al. (2022) Molecular Neurodegeneration 17(1):57. 

6. Granulovacuolar degeneration bodies are independently induced by tau and α-synuclein pathology. Jorge-Oliva, M. et al. (2022) Alzheimer’s Research and Therapy (14)187.

7. Disrupting the α-synuclein- ESCRT interaction with a peptide inhibitor mitigates neurodegeneration in preclinical models of Parkinson’s disease. Nim, S. et al. (2023) Nat Commun 14, 2150.

8. a-Synuclein-dependent increases in PIP5K1γ drive inositol signaling to promote neurotoxicity. Horvath, J. D. et al. (2023) Cell Reports 42, 113244 (Also cited catalog# SPR-480 and SPR-487).

9. Immunization Effects of a Novel α-Synuclein-Based Peptide Epitope Vaccine in Parkinson’s Disease-Associated Pathology. Park, J.S. et al. (2023) Vaccines 11:1820.

小鼠 Alpha 突触核蛋白前体原纤维 (1型)，目录号 SPR-324

The SUMO conjugase Ubc9 protects Dopaminergic cells from cytotoxicity and enhances the stability of α-synuclein in Parkinson’s disease models. Verma, D.K. et al. (2020) eNeuro 0134-20.2020.

Alpha-Synuclein Preformed Fibrils Induce Cellular Senescence in Parkinson’s Disease Models. Verma, D.K. et al. (2021) Cells 10, 1694.

Heat Shock Protein 70 as a Sex-Skewed Regulator of α-Synucleinopathy.Bhatia, T. N. et al.  (2021) Neurotherapeutics Oct;18(4):2541-2564.

Domain-Independent Inhibition of CBP/p300 Attenuates α-Synuclein Aggregation. Hlushchuk, I. et al. (2021) ACS Chemical Neuroscience Jul 7;12(13):2273-2279.

A Novel NOX Inhibitor Treatment Attenuates Parkinson’s Disease-Related Pathology in 小鼠 Models. Ghosh, A. A. et al. (2022) Int J Mol Sci 23, 4262.

Cell Culture Media, Unlike the Presence of Insulin, Affect α-Synuclein Aggregation in Dopaminergic Neurons. Hlushchuk, I. et al. (2022) Biomolecules 12, 563.

Targeted degradation of ⍺-synuclein aggregates in Parkinson’s disease using the AUTOTAC technology. Lee, J. et al. (2023) Mol Neurodegeneration 18, 41.

A Novel NOX Inhibitor Alleviates Parkinson’s Disease Pathology in PFF-Injected Mice. Ofori, K. et al. (2023) preprint.

Genetic and pharmacological reduction of CDK14 mitigates α-synuclein pathology in human neurons and in rodent models of Parkinson’s disease. Parmasad, J.L., et al. (2023) bioRxin preprint.

Identifying Novel Targets and Potential Therapeutics for Parkinson’s Disease. Gosh, A.A et al. (2023) PHD Thesis  Delaware State University.

11. Fluorescent Peptide-based Probe for the Detection of Alpha-synuclein Aggregates in the Gut. Sim, R. (2023) bioRxin preprint.

人 Alpha 突触核蛋白前体原纤维: ATTO-594 (1型)，目录号 SPR-322-A594

Aggregation of alpha-synuclein in enteric neurons does not impact function in vitro. Bindas, A.J. et al. (2022) Sci Rep 12, 22211.

人 Alpha 突触核蛋白A53T 突变型前体原纤维 (1型)，目录号 SPR-326

Environmental enrichment reduced pathological α-Synuclein accumulation by restoring LAMP1 via Reelin in early stage of Parkinson’s disease. Cho, E. (2021) PhD Thesis, Yonsei University.

Reelin Alleviates Mesenchymal Stem Cell Senescence and Reduces Pathological α-Synuclein Expression in an In Vitro Model of Parkinson’s Disease. Cho, E. (2021) Genes 12, 1066.

Reelin protects against pathological alpha-synuclein accumulation and dopaminergic neurodegeneration after environmental enrichment in Parkinson’s disease. Cho, E. et al. (2022) Neurobiology of Disease 175:105898.

人 Alpha 突触核蛋白前体原纤维 (2型), 目录号 SPR-317

Directed Evolution of Antibodies Against Complex Targets. Desai, A. (2021) PhD Thesis, University of Michigan.

Observation of α-Synuclein Preformed Fibrils Interacting with SH-SY5Y Neuroblastoma Cell Membranes Using Scanning Ion Conductance Microscopy. Feng, C. et al. (2022) ACS Chemical Neuroscience. DOI: 101021/acschemneuro.2c00478.

Flow cytometric isolation of drug-like conformational antibodies specific for amyloid fibrils. Desai, A. et al.(2023) bioRxin preprint. (Also cited catalog# SPR-332, SPR-324 & SPR-484)

人 Alpha 突触核蛋白 A53T 突变型蛋白单体 (Type 1), 目录号 SPR-325

Mutant a-synuclein propagates via the lymphatic system of the brain in the monomeric state. Fujita, K. et al. (2023) Cell Reports, 112962.

人 Alpha 突触核蛋白单体 (1型), 目录号 SPR-321

Deciphering the role of hsp110 chaperones in diseases of protein misfolding. Yakubu, U. M. (2021) PhD Thesis, University of Texas.

Suppression of aggregate and amyloid formation by a novel intrinsically disordered region in metazoan Hsp110 chaperones. Yakubu, U.M., Morano, K.A. (2021) J Biol Chem Jan-Jun 2021;296:100567.

人 Alpha 突触核蛋白寡聚体 (动态学稳定的), 目录号 SPR-484

LRP1 is a neuronal receptor for α-synuclein uptake and spread. Chen, K. et al. (2022) Molecular Neurodegeneration 17(1):57.

其他相关产品：

StressMarq的 Alpha 突触核蛋白抗体

总 结

● 多种α突触核蛋白聚集体可诱发疾病

● StressMarq 研发了一系列 α 突触核蛋白，包括： 两种类型的人源 α 突触核蛋白 PFF； A53T 突变型原纤维； N-乙酰化原纤维；小鼠和大鼠 PFF；未成熟的原纤维；动态学稳定的寡聚体；盐酸多巴胺稳定的寡聚体、EGCG 稳定寡聚体、tau 和 α 突触核蛋白共聚集体原纤维

● 一些 PFF 由相同的起始单体原料制成，在 EM 下看起来形态相似，但它们是在不同的条件下聚集生产的PFF

● 不同的α突触核蛋白形式具有明显不同的神经元和生理活性

● 单体、寡聚体、原纤维和纤丝α突触核蛋白都与帕金森病有关.

● StressMarq 提供各种工具用于突触核蛋白病研究

更多详情请联系Stressmarq中国代理商——上海金畔生物