抗体挑选的四个原则

1.要测谁？

确认目标蛋白特性

2.谁去测？

抗体种类

a.单克隆：专一性高，灵敏度较多克隆低

b.多克隆：灵敏度高，批次差异较大

c.重组抗体：批次差异小

抗体验证

3.被谁测？

一抗二抗配对

a.兔配兔，鼠配鼠，一抗二抗想配不出错

b.做免疫组化如一抗宿主种属和样本种属来源相同时，需要注意样本内源性IgG是否与二抗结合产生假阳性

呈色方式

a.HRP,AP呈色

b.荧光（多染时抗体种属或亚型不相同，使用的荧光波长不相近）

二抗专一性

a.使用交叉预吸附型二抗提高抗体专一性

4.在哪测？

做什么应用，用什么抗体

a.环境不同，依应用挑抗体

b.做IP实验时，挑选EasyBlot二抗，去除重轻链干扰

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如何挑选内参抗体

什么是内参？

Western Blot常用来比较不同条件下或不同细胞组织中目标蛋白表达量的相对多少，因此必须先确定上样量相同，才有比较的基础。在Western Blot实验中，可能因总蛋白浓度测定不准确，或是蛋白质上样时因操作产生误差，所以必须设置内部参照组来进行校正。此内部参照必须在不同细胞或组织间表达相对恒定，且有高水平的表达量，来确保不同样品间蛋白定量相同。而这样的参照蛋白，就称为内参，对应的抗体就称为内参抗体。

内参在WB实验中的重要性。

1 用于校正蛋白水平，确保不同样品间蛋白定量（上样量）相同。可从条带粗细初步判定上样量是否有差异。进一步使用影像分析程序将目标蛋白量除以内参含量，所得到的数值即为校正后的目标蛋白相对含量，如此就可以进行目标蛋白相对量的比较。

2 确认转膜、显色等步骤是否均匀转移、呈色。内参一般选用高表达的蛋白，因此也可通过内参的条带，观察WB实验中的转膜、显色等步骤是否有异常。

3对文章发表绝对重要，增加实验的可信度。文章内放上内参的数据，较有说服力，文献审核者也会较相信实验数据。

如何挑内参抗体

通常会挑选各细胞或组织间稳定表达、并且不受实验影响的蛋白作为内参，但不同的实验还是有一些细节要注意，挑选内参可参考下面四点：

常用内参请见下表：

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