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免疫沉淀实验操作指南

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免疫沉淀实验操作指南

该免疫沉淀实验方法仅供参考，由于每个实验使用的试剂不同，并且涉及不同的物种，组织类型及实验应用，实验人员设计应根据具体情况设计实验步骤和改良。

所需试剂

细胞准备:

•Tris 缓冲盐溶液（TBS）. 使用 10x TBS, pH 7.5 (1.0M Tris HCl, 1.5M NaCl). 用适量去离子水稀释到 可在室温下保存一个月 .

•裂解缓冲液. 含有0% 合适洗涤剂的TBS、1mg/ml的 牛血清白蛋白 BSA、合适的蛋白质酶抑制剂.

•稀释缓冲液. 与裂解缓冲液相同, 除去蛋白质酶抑制剂.

•用于裂解物预处理的琼脂糖轭合物. 预吸收裂解物以移除与一抗二抗的非特异结合. 用来自同一物种的琼脂糖标准 IgG做一抗, 抗宿主的二抗. 用稀释缓冲液1:1制备悬浮液.

一抗:

•一抗的对照. 对于多抗血清, 使用来自同一物种的未免疫的血清. 单克隆抗体使用相同亚型和纯度.

•免疫沉淀的琼脂糖轭合物. 使用抗一抗宿主的琼脂糖二抗. 用稀释缓冲液1:1制备悬浮液.

•Tris 缓冲液. 制备05M 的Tris 缓冲液, pH 6.8.

•2x SDS-PAGE 样品缓冲液

•2-巯基乙醇

实验步骤

1.将5 x 107 细胞置于裂解缓冲液中, 在冰上孵育30-60 分钟制备裂解液.

2.涡旋裂解液后置于离心机上250 x g离心10分钟, 除去细胞核留下上清液.

3.将上清液于100,000 x g离心30分钟, 或者微型离心机10,000 x g 离心30分钟, 再取上清液.

4.加入琼脂糖轭合物来预处理裂解液以除去非特异的蛋白结合. 每200 µl 裂解液使用10µl 对照琼脂糖. 于4ºC下震荡1小时. 200 x g离心. 留上清液.

5.向两个微离心管中各加入 200 µl 含有抗原的预处理了的裂解液. 用稀释缓冲液将体积补至 1 ml.

6.向一个离心管中加入一抗. 对于多克隆抗血清或腹水加入5-5 µl一抗. 对组织培养上清液加入 10-100 µl一抗. 向第二个离心管加入同等体积的一抗对照. 冰上孵育1小时.

7.做免疫沉淀时每个管加入50µl琼脂糖轭合物. 4ºC下轻微震荡1小时.

8.于200 x g离心1分钟或微型离心机离心5秒钟. 用移液管小心移出上清液. 用1 ml 稀释缓冲液轻缓重新悬浮底部团块. 重复洗涤. 先用TBS洗涤最后用5 M Tris, pH 6.8洗涤.

9.如上所示再次离心. 加入20-50 µl 样品缓冲液. 混合后在100 ºC加热5分钟. 稍微微离心一下, 将上清液直接用于非还原性电泳SDS-PAGE. 如果需用还原性条件, 将上清液转移到新管中加入5% 2-巯基乙醇. 如上混合加热.

10.电泳蛋白质混合物. 染色凝胶或免疫印迹 (使用我们 Western Blot 的实验方案) 显色. 显现的条带包括抗原的多肽链和使用的抗体.

* 怎样选择正确的珠子:

物种免疫球蛋白亚型Protein AProtein G

人 IgG1  结合力强        结合力强

人 IgG2  结合力强        结合力强

人 IgG3  没有结合力      结合力强

人 IgG4  结合力强        结合力强

人 IgM  使用抗 人 IgM

人 IgE  没有结合力      结合力弱

人 IgA  没有结合力      结合力弱

小鼠 IgG1  结合力弱        结合力强

小鼠 IgG2a  结合力强        结合力强

小鼠 IgG2b  结合力中等     结合力中等

小鼠 IgG3   结合力弱        结合力弱

小鼠 IgM   使用抗小鼠 IgM

大鼠 IgG    没有结合力    结合力弱

大鼠 IgG2a    没有结合力    结合力强

大鼠 IgG2b    没有结合力    结合力中等

大鼠 IgG2c    结合力弱        结合力中等

鸡的 所有亚型  没有结合力   没有结合力

牛的所有亚型结合力中等   结合力强

山羊的所有亚型没有结合力   结合力中等

豚鼠所有亚型结合力强   结合力中等

仓鼠所有亚型结合力弱   结合力中等

马的所有亚型结合力弱   结合力强

猪的所有亚型结合力弱   结合力中等

兔的所有亚型结合力强   结合力中等

绵羊的所有亚型没有结合力   结合力强

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LPS/脂多糖选择指南

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LPS/脂多糖选择指南

LPS-B5 from E. coli 055:B5

cat#tlrl-b5lps(standards),tlrl-pb5lps(Ultrapure)


1.常用于LAL检测中的内毒素标准品

2.常用于体外细胞活化

 

 

应用实例：

●刺激小鼠巨噬细胞中产生促炎性细胞因子分泌[2]

诱导小鼠脾B细胞分泌IL-6[3]

●在大鼠骨髓源性MSCs4中诱导IL-6和生长因子的表达[4]

●诱导硬骨鱼巨噬细胞TNFα和IL-1β的表达[5]

●研究感染猪瘟病毒后，猪组织中TLR4 mRNA的表达[6]

LPS-EB from E. coli 0111:B4

cat#tlrl-eblps,tlrl-3pelps(Ultrapure),

tlrl-lpsbiot(Biotin),vac-3pelps(VacciGrade™)

1.0111:B4菌株是大肠杆菌的一种致病性血清型，已知可引起严重的胃病

2.文献引用量最多的LPS

3.另有VacciGrade™级别，适合用于活体动物研究

4.在体外和体内均有广泛的应用，包括巨噬细胞分化研究

应用实例：

●体外诱导人巨噬细胞(M1)极化[7]

●刺激小鼠巨噬细胞表达siglec蛋白[ 8]

●诱导大西洋鳕鱼和鲑鱼单核细胞的炎症反应[9]

●在小鼠模型中诱导感染性休克和急性肝衰竭[10]

●用于腹腔注射LPS治疗小鼠低铁血症的研究[11]

●在感染诺如病毒的人肠上皮细胞中，诱导形态学改变[12]

LPS-PG from Porphyromonas gingivalis

cat#tlrl-pglps(standards),tlrl-ppglps(Ultrapure)

1.牙周病机制中的一个重要致病因素

2.具有独特的异质性化学结构，有别于传统公认的肠道

3.适用于牙周炎相关研究

InvivoGen畅销产品

应用实例:

●在小鼠和大鼠牙周炎模型中诱发炎症反应[13,14]

●研究风湿病人树突状细胞牙龈卟啉单胞菌诱导的细胞因子反应[15]

●诱导人牙周韧带(PDL)细胞中NF-KB的激活[16]

●刺激人牙髓细胞(HDPCs)研究mRNA表达[17]

●刺激破骨细胞前体细胞，研究破骨细胞基因调控[18]

LPS-EK from E. coli K12

cat#tlrl-eklps,tlrl-peklps(Ultrapure)


1.大肠杆菌K12菌株是典型的实验室菌株

2.拥有异质结构

3.一种有效的TLR4激动剂，主要用于体外试验

 

应用实例:

●在骨髓源性巨噬细胞和人外周血单个核细胞内

刺激促炎细胞因子的产生[19]

●诱导小鼠脾细胞B细胞增殖[20]

●刺激小鼠的造血和气道上皮细胞进行哮喘研究[21]

●用于在HIV感染时刺激树突状细胞和CD4+ T细胞[22]

●诱导COVID-19患者的PBMC产生IL-6、TNF-a和CCL2 [23]

●启动THP-1细胞，促进炎性小体激活[24]

LPS-SM from Salmonella minnesota R595 

cat#tlrl-smlps(Ultrapure)

 

1.仅由脂类A和3-deoxy- d –甘露八酸组成

2. 只提供VacciGrade™级别

3.通常用于体外细胞活化

 

 

 

示例应用:

●刺激肉鸡血小板中促炎细胞因子的产生[25]

●诱导PBMC分泌IL-6、TNF-α和IL-8[26]

●刺激腹腔巨噬细胞产生IL-1β[27] 

●刺激小鼠骨髓来源的树突状细胞产生前IL -1β前体和Caspase 1前体的产生[28]

●诱导大西洋鳕鱼和鲑鱼单核细胞的炎症反应[9]

 

LPS-RS from Rhodobacter sphaeroides (TLR4拮抗剂)

cat#tlrl-rslps, tlrl-prslps(Ultrapure)

 

1. LPS-RS标准品是TLR2的有效激动剂，而LPS-RS超纯特异性拮抗TLR4 

– 拮抗剂浓度超过100倍以上可以完全竞争性抑制LPS活性 

– 能够被LAL试剂检测

 

示例应用:

●抑制人子宫内膜内皮细胞(HEECs)中TLR-4依赖性细胞因子的分泌[29]

●抑制中耳胆脂瘤干细胞(ME-CSCs)的TLR-4依赖性炎症反应[30]

●研究LPS对大鼠急性肺损伤的抑制作用[31]

●研究小鼠血管痉挛和神经损伤的减轻作用[32]

●抑制TLR-4诱导的CD14内吞[33]

 

 

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