免疫组织化学选择指南
一、选择合适的一抗
• 选择感兴趣特定抗原的抗体
• 考虑组织切片的种类和制备 (固定)
• 考虑抗原修复条件
二、选择合适的二抗和三级检测系统
• 选择HRP或AP酶检测系统
• 考虑检测灵敏度需求
• 考虑一抗种属
• 考虑组织切片种类
三、选择合适的酶底物
• 颜色
• 与其他检测系统试剂兼容性（用于多重染
色的复染试剂、封片剂和其他底物试剂等）
四、选择核复染染料
• 蓝色、绿色或红色
• 与底物、封片剂的兼容性
五、选择封片剂
• 水溶性 vs 非水溶性
• 与底物和复染试剂的兼容性
六、观察
• 使用显微镜明场视野进行观察
更多详细信息，请咨询Vectorlabs代理商-上海金畔生物
免疫组化故障排除指南（解决方案）
很多科研的小伙伴在做免疫组化实验时，可能会遇到一些奇奇怪怪的问题，本篇小欣整理了免疫组化故障排除指南，大家可以根据下列的免疫組化故障排除指南来快速找出问题原因，改善您的实验步骤和解决方案。
首先可以从下面几个情况中找到您的免疫荧光染色的问题所在：
一、染色较弱或无染色
可能存在的问题及解决方案：
一抗量不够：
增加抗体浓度
延长孵育时间
一抗二抗不兼容：
二抗应该是抗一抗宿主的。例如，如果一抗是小鼠来源的，那就需要用抗小鼠的二抗
亚型需要兼容
待测组织干透：
在整个染色过程中都需要使样品完全被覆盖于溶液中。
细胞没有通透：
用甲醇或者丙酮固定可以通透细胞
如果使用甲醛固定，用0.2% Triton X-100通透细胞
脱蜡不充分：
加长切片脱蜡时间
确保使用新鲜配制的二甲苯
一抗不适用：
确保抗体被验证过适用于对应类型的IHC, 福尔马林固定, 石蜡包埋, 新鲜冻存切片等等。
• 使用WB先检测抗体，确保抗体没有变质。
组织过度固定：
减少固定的时间
做抗原修复以显现抗原表位
孵育时间太短：
增加一抗和样品孵育的时间
切片储存问题：
样品染色后应该尽快观察，否则信号会随时间减弱。如需要的话，将切片保存在 4⁰C 黑暗处。
抗体储存问题：
反复冻融是对抗体不利的，可引起降解. 最好是在收到产品时将其分成多个小份来保存。
抗体没有按照建议的方式保存. 如果是这样的话可能需要重新购买一支。
如果二抗没有在黑暗处保存 (使用免疫荧光时), 应更换一支新的二抗。
蛋白没有在检测的组织中出现：
做一个阳性对照
如果目标蛋白显现但是信号不强, 增加一个扩大信号步骤
二、高背景染色
可能存在的问题及解决方案：
脱蜡不充分：
加长切片脱蜡时间
确保使用新制的二甲苯
内源的过氧化物酶活性：
如果使用的是HRP检测系统，在进行染色步骤前用3% H2O2 降低内源过氧化物酶活性
内源的生物素：
如果使用的是生物素检测系统，而样品中内源生物素水平又很高 (例如. 肾脏，肝脏，胰脏)，那么需要先使用抗生物素蛋白孵育样品来封闭内源生物素，再进行正常的封闭步骤，然后在一抗孵育前再用生物素封闭。
抗体浓度太高：
进一步稀释一抗/二抗
非特异性结合：
做一个没有一抗的二抗空白对照. 如果有染色，说明二抗有非特异性结合，更换一种二抗，或者使用标记一抗
封闭不充分：
增加封闭孵育时间或考虑更换封闭液。
信号放大过度：
减少信号放大孵育时间，稀释二抗
洗涤不充分：
步骤之间的适当洗涤非常重要. 确保遵循说明说上的洗涤步骤
组织切片太厚：
考虑使用更薄的切片，因为过厚的切片超过了共焦平面的部分会造成过度的背景染色
三、非特异性染色
抗体浓度过高：
降低抗体的浓度和孵育时间
一抗宿主与要染色的组织来源是同一物种 (例. 小鼠抗小鼠的一抗):
• 尝试使用来自不同物种的一抗。或者尝试用二抗宿主的血清来阻断内源的IgG 。或者用 1% Triton 孵育切片以清理组织。或者使用 TBS-Tween 20作为洗涤液而不是用 PBS-Tween 20。
如以上内容未能解决您的需求，可联系我们上海金畔生物相关技术同事，帮您解疑答惑。
免疫细胞化学故障排除指南
根据下列的免疫细胞化学故障排除指南来快速找出问题原因，改善您的实验步骤和解决方案。首先从下列选项中找到对应您免疫细胞化学染色问题的图片:
| 染色较弱或没有染色 | 高背景染色 | 非特异性染色 |
 |
 |
一、染色较弱或没有染色：
细胞从盖玻片上脱离: 减少洗涤步骤或轻缓洗涤；用多聚赖氨酸将细胞黏合到盖玻片上
细胞没有被通透: 甲醇和丙酮固定能使细胞通透性增强；如果使用甲醛, 用0.2% Triton X-100通透细胞
细胞失水变干: 在整个染色过程中样品必须保持覆盖于液体中
细胞固定过度: 减少固定时间
一抗量不够: 提高抗体浓度；加长孵育时间；
孵育时间太短: 增加一抗和样品的孵育时间
切片储存问题: 样品处理之后应该应该马上成像，不然信号会随时间推移而减弱。如果需要可以将切片于 4⁰C 黑暗处储存。
一抗二抗不兼容: 二抗应该是抗一抗宿主的。例如，如果一抗是小鼠来源的，那就需要用抗小鼠的二抗；亚型需要兼容
一抗不适用: 确保抗体验证过可以用于ICC；先在免疫印迹中测试抗体, 确保抗体没有变质
储存问题: 反复冷冻/解冻是对抗体不利的，可引起降解. 最好是在收到产品时将其分成多个小份来保存；抗体没有按照建议的方式保存. 如果是这样的话可能需要重新购买一支；如果二抗没有在黑暗处保存 (使用免疫荧光时), 应更换一支新的二抗。
蛋白没有在检测的组织中出现: 做一个阳性对照；如果目标蛋白显现但是信号不强, 增加一个扩大信号步骤
二、高背景染色
抗体浓度太高: 稀释一抗/二抗
非特异结合: 做一个没有一抗的二抗空白对照. 如果有染色，说明二抗有非特异性结合，更换一种二抗。
阻断不够: 增加阻断孵育时间或考虑更换阻断剂。
信号放大过度: 减少信号放大孵育时间，稀释二抗
洗涤不充分: 步骤之间的适当洗涤非常重要. 确保遵循说明说上的洗涤步骤。
三、非特异性染色
抗体浓度过高: 降低抗体的浓度和孵育时间
一抗产自和待测样本来源同样的物种 (例. 小鼠抗小鼠): 尽量使用来自不同物种的一抗. 或者阻断内源IgG. 还可以尝试在孵育时使用1% Triton 来清洗组织. 或用TBS-Tween 20替换 PBS-Tween 20作为洗涤液。
如有其它问题，请联系Stressmarq代理商-上海金畔生物
TAU蛋白实验操作指南
TAU蛋白实验操作指南
硫黄素T 检测实验操作指南
一.在蒸馏水中制备 1mM 的硫黄素T储备液 (需是新鲜制备并用0.2 µm 注射式过滤器过滤).
二.然后用PBS pH 7.4将每个孔中的硫黄素T 储备液稀释至最终浓度为 25 µM (每孔容量 = 100 µL).
三.向每个孔中加入10 uM肝素.
四.于室温下将分装小份的tau蛋白在使用前进行解冻.
五.将纤维原或单体 (或两者都有) 加入到合适的实验孔中. 用移液器上下吸放混合孔中物质.
六.将孔板密封并放置于震荡孵育器上(800 rpm)，温度为 37°.
七.用 Molecular Devices Gemini XPS 微孔板读板机读取荧光读数, 使用软件是 Softmax Pro 版本为 6.5.1.
八.再次将孔板密封放置于震荡孵育器上, 温度为37°C.
九.在1 到 72 小时之间的固定间隔读数.
孔板: Greiner-Bio 96 Well Non-Binding Cell Culture Microplate, 黑色 (Greiner-Bio Catalog #655900).
XPS 酶标仪参数设置:
温度: 37°C
读取形式: 孔板扫描
波长: 激发光 450 nm，发射光 485 nm
PMT 增益: 自动
闪光每读: 6
震荡: 读数前 20 秒
如需购买TAU蛋白实验相关产品或了解更多实验操作详情，请咨询Stressmarq代理商-上海金畔生物
Surmodics蛋白质稳定性测定指南
蛋白质在免疫测定中起着至关重要的作用。它们充当检测抗原或抗体，用于开发人员检测是否存在疾病状态。保存这些蛋白质是确定准确结果的必要条件。Surmodics™IVD的干蛋白稳定剂和封闭剂旨在保护包覆在多种材料表面上的干蛋白的构象和活性，从而使抗体和抗原长时间保持最佳性能。同时，这些试剂中的封闭机制减少了干扰蛋白的非特异性结合，从而最大限度地提高了检测灵敏度。
此外，开发人员需要使溶液中蛋白质稳定才能用于免疫分析。偶联物稳定剂保留了酶（HRP或AP）以及偶联复合物的抗体或抗原的活性。这允许以较低的使用浓度存储偶联蛋白，以促进试验开发和生产过程中的优化。
Surmodics IVD的StabilZyme™系列在工作强度浓度下提供无与伦比的蛋白质结合物长期稳定性。厂家对HRP偶联物、AP偶联物和一般蛋白应用的多种配方确保了检测开发人员有一整套工具来处理感兴趣的每种蛋白的不稳定性。这些试剂通过保持蛋白质活性和延长保质期，有效改善了蛋白质稳定性测定性能和可制造性。
影响蛋白质稳定性的因素
一般认为蛋白质的结构和环境条件决定了蛋白质的稳定性。外部因素，如温度、pH值和盐、金属离子或其他污染物的存在可能使蛋白质变性。当蛋白质被吸附到实验容器的一侧时，也会变性。蛋白质必须在稳定其天然结构的环境中储存和使用。
蛋白质以冻干形式和溶液形式使用和存储。如果在制备，储存和处理的关键阶段未使用适当的稳定条件，则干燥和冷冻过程可能导致蛋白质变性。
这些因素都极大地影响着蛋白质的稳定性，并最终改变其功能和性质。这是危险的，因为它可以导致沉淀、降解和变性，这将使蛋白质无用。
为什么了解蛋白质的稳定性很重要?
蛋白质广泛应用于许多工业和研究领域。蛋白质的稳定性是建立蛋白质分析时最关键的因素之一。因此，对蛋白质稳定性有一个清晰的认识是至关重要的，因为它对所研究的蛋白质起着重要的作用。许多体外诊断分析的主要目标是创造一个有利的支持环境，使蛋白质样品可以很容易地保留其天然状态。当感兴趣的蛋白质占据非天然聚集结构时，它们就失去了正常功能。蛋白质的稳定性对蛋白质的纯化、表达和储存至关重要。在使用天然蛋白和重组蛋白的功能研究中，它也是至关重要的。
酶联免疫吸附法(ELISA)等检测方法将蛋白(如抗原和抗体)固定在固体载体上，并与显色或荧光分子标记的检测蛋白或与其他生物分子(如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP))结合。不同类型的蛋白质、酶和细胞需要适当的策略来处理和储存，以保持诊断应用的最大功能。
拥有必要的工具来保持蛋白质的稳定性是至关重要的。这就是Surmodics VD的用武之地。我们的干蛋白稳定剂和封闭剂和溶液中蛋白稳定剂已经帮助数以百计的试验开发者保持他们的蛋白质和整体免疫测定的稳定性。
干蛋白质稳定性试剂
Surmodics IVD的干蛋白稳定剂和封闭剂（免疫测定稳定剂）为分析开发人员提供了无与伦比的干蛋白稳定化和阻断效果，使免疫测定的生产流程化。厂家提供三种用于干蛋白质稳定性的独特试剂，StabilCoat™，StabilGuard™和StabilBlock™。这些试剂是行业稳定性和封闭效果的金标准。其结果是简化生产流程的同时，同时提高了测定性能。
使用我们的干燥蛋白稳定剂和封闭剂有几个技术优势。在稳定性方面，这三种干燥蛋白稳定剂均可延长干燥蛋白在各种表面上的保质期，这些表面包括聚苯乙烯板，乳胶珠，磁性颗粒和硝酸纤维素膜。它们也有助于提高测定灵敏度。最后，它们为试验开发人员在试验范围内增加的信噪比，并且还提供了多种配方以优化较低的检测限。这些试剂还通过消除样品基质和其他测定成分的非特异性结合来帮助降低背景。
Surmodics IVD的干蛋白稳定剂：
试验开发人员在分析优化期间选择抗体滴定时需要多种封闭机制。Surmodics IVD的干蛋白稳定剂和封闭剂提供了替代性的封闭机制，可为每种测定法实现最佳的信噪比。
随着StabilBlock的推出，Surmodics现在提供了最佳的可用于减少非特异性结合的试剂，从而提高了免疫测定的信噪比。
StabilCoat免疫分析稳定剂
产品货号：SC01
产品订购：
| 品牌 | 产品名称 | 货号 | 规格 |
| SurModics | StabilCoat Immunoassay Stabilizer | SC01-0050 | 50 mL |
| SurModics | StabilCoat Immunoassay Stabilizer | SC01-1000 | 1000 mL |
| SurModics | StabilCoat Immunoassay Stabilizer | SC01-2000 | 2000 mL |
StabilCoat免疫分析稳定剂可通过有效地封闭板来提高分析的信噪比，同时最大程度地提高抗原/抗体表位的结合能力。
StabilGuard免疫分析稳定剂
产品货号：SG01
产品订购：
| 品牌 | 产品名称 | 产品货号 | 规格 |
| SurModics | StabilGuard Immunoassay Stabilizer (BSAFree) | SG01-0050 | 50 mL |
| SurModics | StabilGuard Immunoassay Stabilizer (BSAFree) | SG01-1000 | 10 mL |
StabilGuard（不含BSA）免疫测定法稳定剂可通过有效地封闭板来增加测定的信噪比，同时使抗原/抗体表位的结合能力最大化。
StabilBlock免疫测定稳定剂
产品货号：ST01
产品订购：
| 品牌 | 产品名称 | 产品货号 | 规格 |
| SurModics | StabilBlock Immunoassay Stabilizer | ST01-0050 | 50 mL |
| SurModics | StabilBlock Immunoassay Stabilizer | ST01-1000 | 1000 mL |
StabilBlock免疫测定稳定剂为测定开发人员提供了最佳的工具，以降低非特异性结合并最大化免疫测定的信噪比。
如需了解有关我们的干蛋白稳定剂和封闭剂的更多信息，请联系我们的代理商上海金畔生物。
用于溶液中蛋白质稳定性的试剂：
Surmodics IVD的溶液中蛋白质稳定剂（结合物稳定剂）为测定结合物提供了金标准，可用于ELISA / EIA，ELISpot，RIA和免疫印迹/western blot应用中的蛋白质结合物在工作强度浓度下的稳定性。我们的StabilZyme HRP，StabilZyme无蛋白和StabilZyme NOBLE稳定剂为试验开发人员提供了一整套工具，可稳定不同的HRP缀合物，以实现长期的溶液内稳定性。
在使用我们的液内蛋白稳定剂时，有几个技术优势。从稳定蛋白质的能力来看，这些试剂可以在工作强度浓度下延长抗体、抗原和其他蛋白质的保质期，并使酶在溶液中保持活性长达两年。
我们的StabilZyme溶液蛋白稳定剂具有出色的实验兼容性。此外，我们提供多种具有不同稳定机制的配方，以满足不同的酶/蛋白质需求。这包括不含蛋白质和不含BSA的配方，以满足特定测定系统的背景要求。同时，这些试剂可在包括ELISA / EIA，ELISpot，RIA，免疫印迹和微阵列应用在内的多种测定中稳定酶和控制材料。
Surmodics IVD的溶液中蛋白质稳定剂：
StabilZyme HRP稳定剂：
商品货号：SZ02
商品订购：
| 品牌 | 产品名称 | 产品货号 | 规格 |
| SurModics | StabilZyme HRP Conjugate Stabilizer | SZ02-1000 | 1000 mL |
| SurModics | StabilZyme HRP Conjugate Stabilizer | SZ02-2000 | 2000 mL |
StabilZyme HRP偶联稳定剂专门针对HRP酶进行了优化，并且是溶液中偶联物稳定性的金标准。
StabilZyme SELECT稳定剂：
商品货号：SZ03
商品订购：
| 品牌 | 产品名称 | 产品货号 | 规格 |
| SurModics | StabilZyme SELECT Stabilizer | SZ03-0050 | 50 mL |
| SurModics | StabilZyme SELECT Stabilizer | SZ03-1000 | 1000 mL |
| SurModics | StabilZyme SELECT Stabilizer | SZ03-2000 | 2000 mL |
StabilZyme SELECT稳定剂是一种通用的溶液中蛋白质稳定剂，可用于免疫分析应用中的HRP结合物，标准品和对照。
StabilZyme NOBLE稳定剂：
商品货号：SZ04
商品订购：
| 品牌 | 产品名称 | 产品货号 | 规格 |
| SurModics | StabilZyme NOBLE Stabilizer (BSA-Free) | SZ04-0050 | 50 mL |
| SurModics | StabilZyme NOBLE Stabilizer (BSA-Free) | SZ04-1000 | 1000 mL |
StabilZyme NOBLE稳定剂消除了在测定系统中使用BSA可能导致的蛋白质干扰和交叉反应。
StabilZyme不含蛋白：
产品货号：SZPF
产品订购：
| 品牌 | 产品名称 | 产品货号 | 规格 |
| SurModics | StabilZyme Protein-Free Stabilizer | SZPF-0050 | 50 mL |
| SurModics | StabilZyme Protein-Free Stabilizer | SZPF-1000 | 1000 mL |
StabilZyme不含蛋白质的稳定剂消除了蛋白质引起的干扰和交叉反应，即使是最敏感的免疫测定也能提供最佳性能。
StabilZyme AP稳定剂
产品货号：SA01
产品订购：
| 品牌 | 产品名称 | 产品货号 | 规格 |
| SurModics | StabilZyme AP Conjugate Stabilizer | SA01-0050 | 50 mL |
| SurModics | StabilZyme AP Conjugate Stabilizer | SA01-1000 | 1000 mL |
| SurModics | StabilZyme AP Conjugate Stabilizer | SA01-2000 | 2000 mL |
StabilZyme AP稳定剂专门优化了AP酶，是溶液中偶联稳定性的金标准。
StabilZyme无蛋白AP稳定剂
产品货号：SAPF
产品订购：
| 品牌 | 产品名称 | 产品货号 | 规格 |
| SurModics | StabilZyme Protein-Free AP Stabilizer | SAPF-0050 | 50 mL |
| SurModics | StabilZyme Protein-Free AP Stabilizer | SAPF-1000 | 1000 mL |
StabilZyme不含蛋白质的AP稳定剂可消除蛋白质引起的干扰和交叉反应，即使是最敏感的免疫测定也能提供最佳性能。
更多详情请联系 SurModics 中国代理商上海金畔生物
免疫荧光实验操作指南
该免疫荧光实验方法仅供参考，由于每个实验使用的试剂不同，并且涉及不同的物种，组织类型及实验应用，实验人员设计应根据具体情况设计实验步骤和改良。
-切片制备
A. 细胞涂片
将培养的细胞生长于无菌的盖玻片或载破片上，37℃过夜孵育。
用PBS简单洗涤。
按需固定. 可用的步骤有:
含10% 福尔马林的PBS 固定10分钟 (保持湿润).
冰冷的甲醇固定5分钟，自然干燥。
冰冷的丙酮固定5分钟，自然干燥。
用PBS冲洗。
B. 冷冻组织切片
在液氮或用液氮预冷的异戊烷中切割冷冻的新鲜组织， 放置于含有OCT冻存液的cryomolds被膜中. 速冻后保存在 – 80 ?C。
用恒冷箱切片机将组织切成4-8 um 厚的切片，然后固定在急冻切片或明胶包被过的切片。使用前将切片保存于 – 80℃。
染色之前，将切片置于室温下 30分钟然后于冰冷的丙酮中固定5分钟。自然干燥30分钟。
在PBS中漂洗。
C. 石蜡组织切片
将切片在二甲苯中去石蜡两次，每次5min.
使用100% 乙醇水化两次，每次3min.
使用95%乙醇水化 1min.
蒸馏水漂洗.
按需根据预制备步骤操作.
-组织切片预制备
*对于非石蜡包埋的冷冻切片和培养细胞，请不要使用该预制备步骤。
被福尔马林固定和石蜡包埋封闭的抗原决定簇可以使用抗原修复剂、酶消化或肥皂精等来使之显示。
-步骤
在PBS-Tween 20 中漂洗切片两次，每次2分钟。
血清封闭: 用正常血清封闭孵育切片 – 物种来源应与二抗相同, 孵育30分钟来封闭非特异的免疫球蛋白结合。 注意：由于该实验使用的 avidin-biotin 检测系统, 根据组织类型不同，可能需要avidin/biotin 封闭，avidin/biotin 封闭应在正常血清封闭之后。
一抗: 在一抗溶液中孵育切片，室温下1小时或4℃过夜。
在PBS-Tween 20中漂洗。
二抗： 在生物素化二抗溶液中孵育切片，室温下30分钟。
用PBS-Tween 20 漂洗三次，每次2分钟。
检测: 在含FITC-Avidin D 的PBS溶液中孵育切片，室温下30分钟。从该步骤开始要确保切片避光，直到最后将切片用铝箔纸包裹或放进避光盒子中。
用PBS-Tween 20 漂洗三次，每次2分钟。
如需要，用PI 或 DAPI 复染色。
在PBS-Tween 20中漂洗。
用95% 乙醇脱水 2 分钟, 100% 乙醇脱水两次，每次3分钟。
用抗褪色固定介质覆盖切片。
如需了解更多免疫荧光实验操作问题及免疫荧光相关产品，请联系上海金畔生物~
免疫印迹实验操作指南
该免疫印迹实验方法仅供参考，由于每个实验使用的试剂不同，并且涉及不同的物种，组织类型及实验应用，实验人员设计应根据具体情况设计实验步骤和改良。
阻断
1.使用 5% 脱脂奶粉溶于 1X TBST 作为阻断缓冲液.
2.使用足够多的阻断缓冲液确保凝胶被完全覆盖.
3.室温下阻断并震荡1小时.
冲洗
1.1X TBST 中冲洗3次，每次4分钟，然后1X TBS中冲洗 3次，每次4分钟.
2.确保在盒子里一直都有足够的冲洗缓冲液.
一抗孵育
1.将一抗在 TBST中稀释.
2.室温下震荡孵育 2 小时.
3.时而检查凝胶确认其完全被抗体溶液覆盖.
冲洗
1.1X TBST 中冲洗3次，每次4分钟，然后1X TBS中冲洗 3次，每次4分钟.
2.确保在盒子里一直都有足够的冲洗缓冲液.
二抗孵育
1.在1X TBST (浓度根据使用的抗体而定) 中制备二抗.
2.室温下震荡孵育 1 小时.
3.时而检查凝胶确认其完全被抗体溶液覆盖.
冲洗
1.1X TBST 中冲洗3次，每次4分钟，然后1X TBS中冲洗 3次，每次4分钟.
2.确保在盒子里一直都有足够的冲洗缓冲液.
检测
ECL检测试剂的用量取决于凝胶的大小. 通常来说, 用量需要足够完全覆盖凝胶.
1.1:1 混合溶液 A 和溶液 B.
2.用镊子夹起凝胶，轻轻拍在无尘擦纸上，去除凝胶上多余的 Tris.
3.把凝胶放在新的干净的盒子里，加入检测试剂，确保凝胶均匀的被覆盖.
4.在黑暗中孵育凝胶 5 分钟.
5.用镊子夹起凝胶，用无尘擦纸洗掉多余的试剂.
6.凝胶成像.
如需购买相关产品，请联系上海金畔生物
免疫细胞化学实验操作指南
该免疫细胞化学实验方法仅供参考，由于每个实验使用的试剂不同，并且涉及不同的物种，组织类型及实验应用，实验人员设计应根据具体情况设计实验步骤和改良。
所需试剂
PBS 洗涤液. 磷酸盐缓冲液 (PBS). 使用 10x PBS, pH 7.2 (0.2M 磷酸钾, 1.5M NaCl). 用适量去离子水稀释到1x.
甲醛固定. 用PBS稀释到 4%.
抗体稀释液. 制备100ml 的PBS 洗涤液，加入1ml 与二抗宿主同物种的正常血清.
生物素化的二抗. 在抗体稀释液中制备生物素化的二抗溶液. 使用抗一抗宿主的生物素化的二抗.
链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶. 在PBS缓冲液中制备链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶溶液.
DAB 底物.
苏木精复染色以及固定介质.
步骤
将细胞生长于显微镜载玻片，或盖玻片，或细胞培养板上。除去培养基液，用冰冷的PBS小心清洗细胞3次。用含4%甲醛的PBS溶液于冰上固定细胞30分钟，使用的甲醛溶液应与最初培养基液体积相等。弃去固定液，用PBS冲洗3次每次5分钟。如需要，可在含1% H2O2 的PBS溶液中孵育5分钟，以除去内源的过氧化物酶活性。用PBS清洗固定的细胞3次，每次5分钟。
用抗体稀释液制备适宜浓度的一抗溶液。移去细胞上的缓冲液。加入足够量的一抗使其覆盖细胞。室温下孵育一抗60分钟。如果一抗与抗原的亲和力较低，可于4?C下过夜孵育。移去一抗溶液。用PBS清洗3次，每次5分钟。
移去细胞上的缓冲液。加入稀释的生物素化的二抗，室温下孵育30分钟。最佳的稀释度每个批次二抗有所不同。用PBS清洗3次，每次5分钟。
移去细胞上的缓冲液。加入稀释的链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶，室温下孵育30分钟。移去溶液。 用PBS清洗3次，每次5分钟。
移去缓冲液。加入DAB底物，孵育大概10分钟或者直到反应颜色足够深。
移去溶液。用蒸馏水清洗3次，每次2分钟。用苏木精复染色，根据浓度和所需颜色深度的不同，染色1至5分钟。用蒸馏水清洗3次，每次2分钟。用100%的乙醇给细胞脱水4次，每次2分钟。用二甲苯清洗细胞4次每次2分钟。加入2~3滴固定介质，固定好盖玻片使之风干。
在显微镜下观察细胞。阳性反应应是可见的棕色沉淀。细胞核应显浅蓝色。
如需购买相关产品，请联系上海金畔生物
ELISA 故障排除指南
根据下列的酶联免疫吸附测定（ELISA）故障排除指南来快速找出问题原因，改善您的实验步骤和解决方案。
首先从下面几个情况中找到您的ELISA的问题所在:
-标准曲线有问题
变异系数 (CV)高
高背景
样品读数过高
样品读数过低
注意: 如果使用的是StressXpress? ELISA 检测试剂盒，请参照 StressXpress? ELISA 的故障排除指南。如果使用的是自己制作的ELISA试剂盒，请参考其他的ELISA试剂盒故障排除指南。
标准曲线有问题
标准品制备不当:
StressXpress® – 确保正确计算和实施了标准品稀释度
StressXpress® – 在打开标准品之前要离心
如果标准品是冻干粉，在稀释之前确保所有的成分都已经溶解
使用精准的移液器，并确保操作正确
标准品降解了:
StressXpress® – 确保标准品按照指示保存，以避免降解发生
使用新鲜的标准品
标准曲线不拟合:
使用不同的标度或者曲线拟合
移液错误:
确保多道移液器是校准好的
-变异系数 (CV)高
酶标板孔底部搅乱:
移液时避免接触孔板底部。将移液器吸头对准孔壁，避免搅乱孔底区域。
孔中加试剂量不对:
StressXpress® – 根据说明书上的要求对每个孔加一定量的试剂
如果使用自动清洗系统，确保每个端口干净无阻碍。
边缘效应:
确保整个孔板温度一致，并且试剂都是室温。
移液错误:
保证多道移液器是校准好的
清洗错误:
确保每次洗板前彻底移除所有孔中的缓冲液
样品不均一:
使用前将样品和试剂充分混合确保均一性
如果必要，将溶液中颗粒离心出来
振荡混合不充分:
确保在所有的孵育步骤时将酶标板放到振荡器上
孔间污染:
避免使移液器吸头与孔壁或孔中的试剂接触
如果每次孵育使用同一个封板膜，确保试剂没有沾染到封板膜上
-高背景
洗涤不充分:
StressXpress® – 按照说明书上指示的正确洗涤剂量和次数洗涤
在加底物溶液之前增加洗涤剂量和洗涤次数
样品蒸发了:
用试剂盒中提供的封板膜或parafilm将酶标板紧密覆盖
空白对照有误:
StressXpress® – 按照说明书要求正确混合空白对照的试剂
确保其他孔的读数都减去了空白对照的读数
反应没有终止:
StressXpress® – 确保每孔加入了正确剂量的终止液
使用新鲜的终止液
TMB 曝光失效:
使用前将TMB保存于遮光小瓶中
TMB 污染了:
在将TMB加入各孔前确保 TMB 清澈透明
空白孔受污染:
避免使多道移液器吸头触碰到板孔或孔中的试剂
酶标板底部不洁:
彻底清洗酶标板底部
-样品读数过高
样品浓度太高:
StressXpress® – 按照实验步骤里指示的稀释样品或根据特殊样品优化稀释步骤
增加样品稀释度
HRP 浓度错误:
StressXpress® – 确保按照实验步骤里指示的稀释度使用HRP
孵育时间太长:
StressXpress® – 按照实验步骤中指示的孵育样品
减少孵育时间
-样品读数过低
抗原水平过低:
StressXpress® – 按照实验步骤里指示的稀释样品或根据特殊样品类型优化稀释步骤
降低样品的稀释度或者浓缩样品
反应时间太短:
StressXpress® – 根据实验步骤决定最佳反应时间
适量增加反应时间
孵育时间太短:
StressXpress® – 根据是实验步骤里描述的孵育样品
增加孵育时间
孵育温度过低:
StressXpress® – 按照实验步骤中指示的温度孵育样品
优化孵育温度
酶标板过期:
StressXpress® – 查看试剂盒包装上的保质期
包被新的酶标板
抗体浓度过低:
StressXpress® – 使用实验步骤里指示的抗体浓度
增加抗体浓度
底物不在室温:
所有试剂使用前都必须保持室温 (25⁰C)
波长不对:
确保酶标板读数时使用的合适的波长
酶标板读数延迟:
加入终止液后应立即读数，不要延迟
样品类型不适用:
StressXpress® – 确保使用的物种和样品类型是经验证过适用于该试剂盒的
洗涤过度:
StressXpress® – 根据实验步骤使用合适的洗涤量和次数
将洗涤液轻缓移至板孔中
如果使用的是洗涤系统，确保压力合适
板孔干透:
实验操作时不要让板孔干透
更多详情请咨询Stressmarq优势代理商-上海金畔生物
免疫组化实验操作指南
该免疫組化实验方法仅供参考，由于每个实验使用的试剂不同，并且涉及不同的物种，组织类型及实验应用，实验人员设计应根据具体情况设计实验步骤和改良。
所需试剂
丙酮
乙醇，无水变性的，组织学分级 (100% 和 95%)
蒸馏水
苏木精
二甲苯
10X TBS: 制备 1 升10X TBS：24.2g Tris base, 80g NaCl; 用HCl (使用 1X) 将pH 调至 7.6 。
洗涤液 TBS/T: 1X TBS, 0.1% Tween-20: 制备 1 升需将100ml 的 10x TBS 加入到 900 ml 双蒸馏水中。加入1ml Tween 20 然后混合。
10 mM 柠檬酸钠缓冲液： 制备 1 升需将 2.94g 柠檬酸钠加入到 1 升的蒸馏水中。将 pH 调至 6.0。
3% 过氧化氢： 制备需将10ml 30% H2O2 加入到 90ml 蒸馏水中。
封闭液: 5% 马血清或山羊血清溶于TBS
ABC 试剂: 在使用前30分钟根据制造商说明制备。
DAB 试剂: 根据制造商说明制备。
组织制备
A. 新鲜冷冻切片
组织制备
在液氮中将组织切成小块 (5 mm x 5 mm x 3 mm)。
转移到恒冷箱切片机中, 切成5–30 μm薄的切片，将切片转移至带正电荷的载玻片上 (poly-L-lysine 包被的).
室温下干燥切片 (若当天染色则干燥1-2 小时，直至完全干燥)。注意：彻底干燥才能保证组织恰当地粘附在切片上。
固定方法
可用的固定方法有很多种. 应遵循产品说明书上指定的方法或找到适宜样品的最佳方案。
冷丙酮: -20°C处理10分钟。自然干燥。
甲醇: -20°C处理10分钟。
10% 中性甲醛溶液: 室温下10分钟。
3% 甲醛: 室温下15分钟。
3% 甲醛/甲醇: 室温下15分钟，然后用甲醇 -20°C处理 5 分钟 (中间不要漂洗)。
用PBS （pH 7.4 含1% Tween 20）漂洗切片3次，每次5分钟。
B. 固定的, 冷冻组织切片
使组织充满固定剂或将组织浸入到固定剂中一段时间。最常用的固定剂是4% 多聚甲醛。
将组织浸没于冻存保护液（其中含有含10-30%蔗糖的PBS）中。当组织沉入溶液中后冻存保护就完成了。
从冻存保护液中取出组织，保存于 -70°C 直到切片。
将组织从 -70°C 冰箱取出，在-20°C平衡15分钟 然后再切片。-20°C平衡帮助避免切片时的断裂。
用恒冷箱切片机将组织切成 10-15um 的切片，收集切片置于载玻片上。通常每个载玻片可以放置3片切片，留出足够间距。
充分干燥切片。可使用自然风干或切片加热器，通常需要过夜或在40-50°C下至少干燥2~3小时。
制好的切片可以干燥保存在 -70°C 直至染色。 在复水染色前要先平衡至室温并适当干燥。
C. 石蜡包埋切片
脱蜡和水化切片
二甲苯：换 2-3 次，每次5分钟。
100% 纯乙醇：换2次，每次3分钟。
95% 乙醇: 换2次，每次3分钟。
80% 乙醇：3分钟。
50% 乙醇：3分钟。
蒸馏水，PBS，或 Tris buffer：换2次，每次3分钟。
注意: 一旦组织切片复水，不要使之干透。用吸水纸吸干组织切片周围。用钻石划针，免疫組化笔，陶瓷记号笔, 或指甲油在载玻片上将切片圈起来。这个圈可以在接下来的孵育过程中使溶液留存于切片上。
抗原修复
很多抗原的可视性可以通过抗原修复来提高，抗原修复可以打破福尔马林固定时形成的蛋白质交联，从而使被掩藏的抗原显现出来。抗原修复技术包括不同时间长度的加热或者利用蛋白酶来做酶消化，例如蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。
加热的方法通常会用到微波炉，高压锅，蒸箱或水浴。将样品在接近100°C高温加热20分钟后再冷却同等的时间。最常用的抗原修复液有 a) 柠檬酸盐缓冲剂, pH 6.0, b) Tris-EDTA, pH 9.0 和 c) EDTA, pH 8.0.
如需要可用柠檬酸盐缓冲剂做抗原修复：
柠檬酸盐缓冲剂配方:
10mM 柠檬酸钠, 0.05% Tween-20, pH 6.0 或
10mM 柠檬酸, 0.05% Tween-20, pH 6.0
将含有柠檬酸钠或柠檬酸盐缓冲剂的染色盘放到蒸箱或者水浴中，预热到95-100 °C。
将切片浸没于染色盘中。盖子虚掩，孵育20-40 分钟 (研究者需自己决定最佳的孵育时间)。
关掉蒸箱或水浴，将染色盘置于室温下，让切片冷却20分钟。
在TBS-Tween-20中漂洗切片2次，每次2分钟。
开始封闭步骤。
过氧化氢孵育
阻断内源性过氧化物酶 (如需要):
1.将切片浸入到 0.3-3% H2O2 和 100% 甲醇中，室温下10-30 分钟。
2.在蒸馏水中漂洗切片，换2次，每次5分钟。
免疫组化实验方案
封闭步骤:
用3-10% 来自二抗宿主物种的正常血清孵育切片30分钟，以阻断非特异的抗体结合。
移去封闭液。
一抗孵育
*所有步骤需在湿润的环境中进行。
在封闭液中稀释一抗。如果没有建议的稀释度，从 1:10, 1:100 和 1:1000开始。
4°C 孵育过夜。
移去抗体溶液。用PBS，pH 7.4 洗涤3次，每次5分钟。
如果一抗是HRP-标记的，直接开始显色步骤。
二抗孵育
根据建议的稀释度在封闭液中稀释生物素–标记的二抗。室温下孵育 30-60 分钟。
移去二抗溶液。在洗涤液中清洗3次，每次5分钟。
显色
向每个切片中加入链霉亲和素–辣根过氧化物酶试剂，室温下孵育30分钟。
移去 ABC 试剂。用洗涤液清洗切片3次，每次5分钟。
在湿润的环境下用 DAB 溶液彻底覆盖切片。室温下孵育 5-15 分钟。或者，在显微镜下观察切片来决定最佳的不溶沉淀物颜色深度。
一旦显色，用蒸馏水小心冲洗以终止反应。
如需要可以用苏木精和曙红对组织进行复染色。
用蒸馏水清洗切片。
复水以及加盖玻片
样品复水：使用一系列不同浓度的甲醇或乙醇– 50% (2 x 5 min), 75% (2 x 5 min), 最后 100% (2 x 5 min)。
用二甲苯重复上述步骤，孵育切片两次，每次10秒钟。
使切片自然干燥。
用合适的固定介质固定好盖玻片。
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