炎症小体的调节

炎症小体通过释放炎性细胞因子和警报素导致细胞焦亡，来构成快速而强效的免疫防御。这些异动必须小心调控在一定的损伤范围内，同时塑造出随后的适应性免疫反应。因此，严格调节炎症小体除了保证充份的免疫保护外，也防止不必要的激活，限制附带组织的损伤。 炎症小体应答的所有步骤中都存在多层防护措施。

调节炎症小体的复杂性很大程度上建基于所涉及分子的多样性。实际上，炎症小体需要依赖传感器（例如NLRP3、NLRC4和NAIP）、接头蛋白和支架蛋白（例如ASC和NEK7）、炎性caspase（CASP-1和CASP-11/4/5）、成孔蛋白（例如GSDMD）、炎性细胞因子（IL-1β和IL-18）和警报素蛋白（例如IL-1α）的不同参与者。这些分子都在基因组和蛋白水平上受到不同程度的控制。

启动步骤可转录上调可转录上调处于较低本底水平的炎症小体成分和效应蛋白 [4, 67]。PRR激动剂是触发转录因子（主要是NF-κB 和干扰素调节因子（IRFs））活化的主要启动剂。例如，NLRP3和Pyrin的表达是由NF-κB介导的，而鼠源NAIP的表达依赖于IRF8。现时对于ASC接头蛋白和CASP-1的转录调控知之甚少，尚有待进一步的研究了解。非经典炎症小体CASP-11/4/5会根据细胞类型而

有差异地上调。成孔蛋白GSDMD以及细胞穿透蛋白GBPs和IRGB10的表达分别依赖于IRF1/2和IRF1。IL-1α警报素、pro-IL-1β和pro-IL-18细胞因子的诱导表达则似乎依赖于不同的转录因子，详细机理仍在研究中。不过已知的是，转录上调对于pro-IL-1β是必须的。

炎症小体还受翻译后修饰（PTMs）的调控，这些修饰包括磷酸化，泛素化，去泛素化和蛋白水解切割 [44, 81]。 PTM由不同的刺激（例如PRR激动剂或炎症小体传感器的诱导剂）触发，并可以定位到同一炎症小体的特定残基上，从而导致不同的结果。虽然NLRP3的调控已有广泛的研究，但其他受PTM调控的炎症小体分子，包括ASC，CASP-1和pro-IL-1β仍有待探讨 [44, 81]。值得注意的是，由PTM驱动的调节功能可确保炎症小体平台组装所需的构象变化。此外，CASP-1和CASP-11/4/5的自我激活、pro-IL-1β/IL-18转化为其生物活性形式以及GSDMD释放N-末端结构域的过程都需要经蛋白水解进行切割。PTMs的其他调节功能包括终止应答，例如诱导已组装的炎症小体向自噬小体的递送 [45, 84, 85]。由于PTMs控制着炎症小体反应的多个步骤，并且依赖于酶的活性，它们因此成为具吸引力药物靶点，调节参与炎症性疾病的炎症小体。

启动(Priming)试剂

LPS

脂多糖（LPS）为革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌）外膜的主要成分，是一种强效的先天免疫系统诱导剂。它在细胞表面被TLR4识别，使TLR4与CD14和MD-2形成复合物，触发信号级联反应，导致NF-κB和IRF3转录因子的激活 [83]，以及促炎性细胞因子和I型干扰素的产生。要避免巨噬細胞经佛波酯

（PMA）诱导分化后出现高背景的情况，可以在PMA刺激后使用LPS预处理约1周。

Poly(I:C)

聚肌胞苷酸（Polyinosine-polycytidylic acid）简称Poly(I:C)，是双链RNA（dsRNA）的合成类似物，也是与病毒感染相关的PAMP。Poly(I:C)除了激活TLR3，也也可以激活RIG-I/MDA5和PKR，从而通过NF-κB和IRF途径诱导炎性信号 [84, 85]。

Pam3CSK4

Pam3CSK4（或Pam3CysSerLys4）是细菌细胞壁脂肽酰化氨基末端的合成模拟物。它是一种强效的TLR2激活剂，通过与TLR1的协同作用，诱导NF-κB的活化 [86]。我们建议使用Pam3CSK4启动RAW264.7衍生的巨噬细胞，以避免出现高背景的情况。

如果要诱导人源CASP-4/5和鼠源CASP-11非经典炎症小体的表达，我们高度推荐使用IFN-γ来预处理细胞（产品可咨询上海金畔生物）。

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炎症小体的细胞实验

InvivoGen提供了用于炎症小体研究的细胞实验工具，并不断扩充这一连串的产品系列。人源单核细胞系THP-1由于表达高水平的NLRP3、ASC和pro-caspase-1而被广泛用于炎症小体的研究。为了帮助您评估特定炎症小体在经典和非经典炎症反应中的作用，我们设计了THP1或RAW264.7衍生细胞，它们敲除（KO）或敲低了（def）NLRP3、ASC、 CASP-1、CASP-4、CASP-11、NLRC4和GSDMD的基因表达。此外，这些细胞可作为对照，应用于筛选新疗法上。这些细胞系的功能验证均使用了HEK-BlueTM IL-1β细胞来检测生物活性 IL-1β 的释放（可咨询上海金畔生物索要相关资料）。

监测NLRP3依赖性应答

THP1-KO-NLRP3 Cells

THP1-KO-NLRP3细胞敲除了NLRP3基因的N端区域，此基因敲除通过了DNA测序、PCR和Western blot验证。这些细胞表达一个非活性NLRP3的C末端片段，因此，它们与尼日利亚霉素或氢氧化铝孵育后，会使IL-1β的分泌和细胞焦亡的发生被阻断。值得注意的是，在Poly(dA:dT)或大肠杆菌外膜囊泡（OMVs）的刺激下，IL-1β的分泌在cGAS-STING-NLRP3或CASP-4/5炎症小体激活时受到严重损害。因此，THP1-KO-NLRP3细胞可以用来区分NLRP3和其他炎症小体传感器的激活。

NLRP3：一个具吸引力的药物靶点

NLRP3的活化可由多种刺激物介导，然而这种拮抗感染的进化优势也可以是一种负担。事实上，NLRP3与多种疾病有关，如2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、痛风性关节炎、阿尔茨海默病和癌症，因此NLRP3成为了具吸引力的药物研发靶点 [34, 35] 。

监测NLRC4依赖性应答

THP1-KO-NLRC4 Cells& RAW-ASC KO-NLRC4 Cells

THP1-KO-NLRC4 细胞敲除NLRC4的核苷酸结合域（NDB），使得NLRC4蛋白无法为炎症小体的组装而聚合（见第9页）。RAW-ASC KO-NLRC4细胞稳定表达鼠源ASC基因（一般在

RAW264.7细胞中缺失[36]），并经DNA测序、PCR和Western blot证实敲除了双等位基因NLRC4。THP1-KO-NLRC4和RAWASC-KO-NLRC4细胞在分别与Needle-Tox和Rod-Tox孵育时，显示了受损的IL-1β分泌和细胞焦亡。重要的是，两种KO细胞系对其他炎症诱导剂（如Poly(dA:dT)）的应答仅受到轻微影响。

监测ASC依赖性应答

THP1-KO-ASC Cells

THP1-KO-ASC细胞经DNA测序、PCR和Western blot证实，具有ASC基因的双等位基因KO。这些细胞可以用来确定炎症小体是否需要ASC来激活。值得注意的是，它们对NLRP3或CASP-4诱导剂的应答严重受损。

监测CASP-1依赖性应答

THP1-defCASP1 Cells

THP1-defCASP1细胞比其THP1-Null母细胞系表达约少7倍的caspase-1，强烈欠缺capase-1活性。这细胞系有助于筛选新型炎症小体诱导剂。

研究特定炎症小体的工具

单核细胞和巨噬细胞是处于免疫防御前线的天然细胞，因此是研究炎症小体信号最广泛使用的细胞类型。

骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）是经过体外分化的原代细胞。

THP-1 细胞系是一种表达高水平NLRP3、ASC和pro-caspase-1的人源单核细胞系 [37] 。

敲除（KO）和敲低（KD）用于研究特定的基因功能，以及它们是否能被另一个基因所补偿。

化学抑制剂可以辅助KO/KD细胞系工具。这些小分子虽然具阻断蛋白的功能，但仍可以允许蛋白组装成大分子复合物。

监测CASP-4依赖性应答

THP1-KO-CASP4 Cells

THP1-KO-CASP4细胞经DNA测序、PCR和Western blot验证，具有CASP4基因的双等位基因KO。这些细胞与预期中一样，对NLRP3诱导剂（如尼日利亚霉素）的应答不受影响，而对CASP-4诱导剂（如转染的LPS）的应答则受到阻碍。尽管CASP4基因已完全敲除，但可能由于被CASP-5部分激活，这些细胞在转染LPS后仍分泌可检测水平的IL-1β。

InvivoGen还提供从RAW-ASC细胞系产生的 RAW-ASC KO-CASP11细胞。这些细胞具有CASP-11基因的双等位基因KO，它们对非经典炎症小体诱导物（如转染的LPS或大肠杆菌OMVs）的应答受损。

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检测炎症小体的激活及监测方法

炎症小体的激活有多个重要的特征，如ASC斑点的形成、促炎性细胞死亡、具有生物活性的IL-1β/18细胞因子的分泌以及HMGB1的表达。为了检测这些关键的特征，InvivoGen开发了体外研究炎症小体激活中最常用的人源THP-1单核细胞系模型和广泛用于报告系统的人源HEK293胚胎肾细胞系所衍生的细胞工具。

检测炎症小体激活的方法

1.使用RT-qPCR检测NF-κB诱导的pro-IL-1β和NLRP3上调

2.使用荧光显微镜或流式细胞术监测细胞系中ASC斑点的形成

3.使用 Western blot 检测 caspase-1 的裂解或 pro-IL-1β/IL-18 的成熟

4.使用ELISA测定IL-1β、IL-18或HMGB1的释放

5.使用乳酸脱氢酶（LDH）测定或碘化丙啶（PI）染色法检测细胞焦亡

6.使用检测IL-1β、IL-18分泌的报告细胞系

以上方法各有利弊，可以适当的结合这些方法来检测炎症小体的激活。

实时监测ASC斑点

THP1-ASC-GFP Cells

THP1-ASC-GFP细胞可通过荧光显微镜观察活细胞中ASC斑点的形成。它们以依赖NF-κB的方式稳定表达ASC::GFP融合蛋白。在诱导剂如Poly(dA:dT)的刺激下，炎症小体的激活可以通过观察荧光ASC斑点的组装来分析，不会干预炎症小体的应答。

监测细胞焦亡

THP1-HMGB1-Lucia™ Cells

THP1-HMGB1-Lucia™细胞是一种可靠、方便的定量检测细胞焦亡的工具，能取代测定LDH活性的经典方法。此测定依赖于细胞溶解介导的HMGB1警报素，通过与Lucia荧光素酶的融合来测量其释放。THP1-HMGB1-Lucia™细胞经LPS启动和炎症诱导剂如Poly(dA:dT)处理后引发细胞焦亡，从而释放HMGB1::Lucia到细胞外环境中。通过测量QUANTI-Luc™检测试剂产生的光信号，可以简单监测上清液中HMGB1::Lucia的水平。

实时监测IL-1β和IL-18的分泌

InvivoGen已开发出报告细胞系，能简单、快速、可靠地检测和定量具有生物活性的人源（h）或鼠源（m）IL-1β和IL-18。这些细胞来源于人源胚胎肾HEK293细胞系。在激活细胞因子信号通路后，它们表达由NF-κB/AP-1诱导的分泌型碱性磷酸酶（SEAP）报告基因。使用QUANTI-Blue™溶液检测试剂可以很容易地监测上清液中的SEAP水平。

HEK-Blue™ IL-1β Cells& HEK-Blue™ IL-1R Cells

这些细胞可以监测样本中的hIL-1α/β、mIL-1α/β。两种细胞系均表达内源性人源IL-1受体（hIL-1R）。HEK-Blue™ IL-1β细胞对人源IL-1异构体的敏感性高于鼠源的异构体。我们建议使用此细胞系来进行人源炎症小体细胞实验(例如THP1衍生分析，见第6-7页)，测试上清液样本。HEK-Blue™ IL-1R细胞被稳定转染表达mIL-1R，赋予对mIL-1β更高的敏感性。因此，该细胞系更适合于从小鼠的血清或细胞突变物中检测IL-1β。然而，它们的高灵敏度可以导致一些细胞（例如RAW264.7衍生细胞）出现高背景。

值得注意的是，这两种细胞系都可以用来评估样本中IL-1α警报素的水平。HEK-Blue™ IL-1β 和 HEK-Blue™ IL-1R细胞检测一种亚型的特异性可通过在分析中加入针对另一种亚型的中和抗体来评估。

HEK-Blue™ IL-18 Cells

这些细胞提供了一个强大的细胞实验平台，监测样本中hIL-18和mIL-18的浓度。HEK-Blue™ IL-18细胞经转染稳定表达hIL-18受体。这些细胞对hIL-18比mIL-18敏感。

使用Invivogen的细胞因子传感器细胞

1.检测具生物活性的细胞因子

2.具成本效益

3.短时间的实验操作

4.肉眼可视化实验结果

5.高灵敏度、高动态范围

6.适用于药物筛选（正常或高通量筛选、药物效应动力学等）

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文献参考：

Martine P. et al. 2019. Cell Death Dis. doi: 10.1038/s41419-019-1491-7. HSP70 is a negative regulator of NLRP3 inflammasome activation.

Metho S. et al. 2019. Mol. Cell. doi: 10.1016/j.molcel.2018.11.08. The Crohn’s disease risk factor IRGM limits NLRP3 inflammasome activation by impeding its assembly and by mediating its selective autophagy.

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研究炎症小体的未来趋势如何？

炎症小体是一种胞浆蛋白复合物，能够快速识别及抵御微生物和非感染性的侵袭。它们充当信号枢纽来诱导炎性细胞因子的成熟和分泌，继而引发免疫原性细胞的溶解性死亡，即细胞焦亡。

过去二十年间，研究人员在免疫细胞和非免疫细胞都发现多种炎症小体的传感器。这显示炎症小体是先天免疫防御的重要前哨，其激活有助清除病原体。虽然如此，它也可在自体炎症、神经退行性疾病和代谢性疾病等条件下导致无菌的炎症反应发生。相关疾病的例子有痛风性关节炎、阿尔茨海默病和2型糖尿病。此外，炎症小体在癌症中具有双向作用，既可以保护宿主，也可以促进肿瘤生长。

NLRP3是典型炎症小体的代表，且最为广泛研究，并与多种疾病和症状紧密关连。虽然其确实的激活机制仍存在争议，NLRP3已是开发炎症小体调节剂的生物技术公司中的热门靶点，如Inflazome、IFM Therapeutics、Nodthera和Jecure这些公司都专注于NLRP3的小分子拮抗剂的开发。在患上高死亡率疾病越趋普遍的现代社会中，这种拮抗剂可能成为理想的治疗药物。

虽然我们在理解炎症小体及其对人体健康和疾病的影响上取得了重大进展，但仍有些问题尚未解开。例如各种炎症小体传感器在多大程度上参与了先天免疫防御？炎症小体是专门针对某一特定的威胁，还是能协同发挥作用？大量的研究工作已经反映了调节炎症小体的复杂性，为开发介入治疗开辟了新的途径。

炎症小体的黄金时代尚未到来……

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炎症小体与疾病

在过去的一个世纪，现代社会已经历疾病转型，非传染性疾病正式取代传染性疾病成为主要死因。大多数的非传染性疾病与炎症小体有关，其中NLRP3与许多病理学有密切关系。现时临床上使用不同的方法来克服炎症相关疾病对公共卫生带来的巨大影响。

非传染性疾病

NLRP3的功能获得型（gain-of-function）突变可以导致如Cryopyrin相关的周期性综合征（CAPS）的自身炎症性疾病。其他炎性症状包括2型糖尿病、痛风性关节炎、癌症、心血管疾病和阿尔茨海默氏症，都是与NLRP3介导的慢性炎症反应有关，这些炎症继发于无菌危险信号在组织的积累 [35]。另外，白癜风、艾迪生病和1型糖尿病等自身免疫疾病与NLRP1的单核苷酸多态性有关 [46]。家族性冷性自身炎症综合征（FCAS）、小肠结肠炎和复发性巨噬细胞活化综合征（MAS）则与NLRC4的突变有关 [15]。而Pyrin的功能获得型基因突变与家族性地中海热（FMF）相关 [15]。

细胞因子风暴

炎症细胞因子的过度分泌可导致器官衰竭和死亡。NLRP3诱导的炎症反应失调与中毒性休克样症状（如链球菌中毒性休克样综合征（STSLS））[102]以及急性呼吸窘迫症状（如SARS-CoV-2病毒所引起的新型冠状病毒肺炎（COVID-19））等有关 [103]。

治疗方法

大多数临床认可的治疗方法旨在阻断炎性IL-1β/IL-1R信号。重组人源IL-1R拮抗剂Anakinra、抗IL-1β单克隆抗体Canakinumab和人源IL1R-Fc融合蛋白Rilonacept均有效治疗CAPS。这些药物也可能有助于代谢性和神经退行性相关炎症 [36]。另一方面，类似于IL-1阻断剂，靶向IL-18信号的Tadekinig alfa和GSK1070806已进入临床试验阶段 [36]。然而这些药物有其局限性，包括缺乏特异性靶点和增加感染风险。目前另一个有望的治疗方法是使用特定炎症小体传感器作为药理学抑制剂，其中一种特殊的NLRP3抑制剂MCC950是重要的例子 [99, 100]。它的效率在小鼠炎性疾病模型中得到了证实，并已在类风湿关节炎的II期临床试验中测试。虽然MCC950被发现会引起肝脏毒性 [35, 36]，但它成功帮助研究人员改良出更有效安全的分子。

重要的是，慢性炎症亦可导致癌症。一旦建立了肿瘤，它会生长在抑制性环境中以逃避免疫反应。因此，诱导细胞焦亡的化合物有望杀死癌细胞并改善抗肿瘤T细胞反应 [104]。

参考资料：

15. Xue, Y., et al., Trends in Immunology, 2019. 40(11): p. 1035-1052.

35. Mangan, M.S.J., et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2018. 17: p. 588.

36. Chauhan, D., L. Vande Walle, and M. Lamkanfi, Immunol Rev, 2020. 297(1): p. 123-138.

46. Platnich, J. and D. Muruve, Archives of Biochemistry and Biophysics, 2019. 670.

102. Lin, L., et al., PLOS Pathogens, 2019. 15(6): p. e1007795.

103. Freeman, T.L. and T.H. Swartz, Frontiers in Immunology, 2020. 11(1518).

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