双链RNA的感受器NLRP1—人源NLRP1识别RNA病毒感染活化炎症小体

炎症小体（Inflammasomes）是机体免疫细胞内识别炎症性或损伤性刺激完成活化的炎症复合体。其功能实现通过位于胞质的感受器（如NLRP3、AIM2等）实现炎症小体组装，完成对炎症性Caspase（Caspase-1/4/5）的活化。炎症性Caspase进一步通过活化IL-1β/18增敏免疫系统，并水解Gasdermin引发焦亡【1】。

炎症小体感受器主要包括NLR（Nucleotide-binding domain Leucine-rich Repeat）家族成员，其中最经典研究最广泛的是NLRP3蛋白。NLR家族蛋白普遍含有LRR（Leucine-rich Repeat）结构域，可直接识别上游炎症信号。但作为第一个被发现的炎症小体感受器NLRP1却一直是该家族中比较特殊的存在【2】，关于它的具体功能和激活方式在长期以来存在争议:

1）经典的NLRP3含有PYD结构域，必须通过接头蛋白ASC才能结合Caspase-1完成炎症小体的组装。但NLRP1同时含有N端的PYD和C端的CARD结构域，所以既往研究认为，NLRP1既可以通过ASC，也可以不依赖ASC激活Caspase-1【3】；2）早期研究已发现 NLRP1通过识别炭疽杆菌（Bacillus anthracis）的致死因子LF（lethal factor）激活，机制一直不清。在去年Science背靠背发表的研究同时发现炭疽杆菌（Bacillus anthracis）的致死因子LF（lethal factor）通过依赖蛋白酶体的N端降解方式水解NLRP1的N端序列，暴露出活性的C端UPA-CARD结构域，可以直接结合Caspase-1的CARD而不依赖ASC完成活化【4, 5】（详见bioart文章: Science 背靠背| 破解NLRP1炎症小体的活化之谜）。近期发表的Science研究也再次发现鼻病毒内HRV 3C蛋白酶也能水解NLRP1实现类似的活化过程【6】。在如此多研究证实NLRP1通过C端CARD完成活化的机制后，其N端的PYD以及NACHT结构域却一直未能崭露头角。

慕尼黑工业大学的Veit Hornung课题组长期关注固有免疫中病原识别受体的功能，日前在Science发表题为 Human NLRP1 is a sensor for double-stranded RNA 的研究，发现皮肤组织内的NLRP1是RNA病毒感受器，PYD识别dsRNA后通过NACHT水解ATP实现活化，依赖ASC和Caspase-1完成炎症小体组装，从而激活IL-1beta和GSDMD引起炎症反应。

研究人员首先关注到，在上皮屏障组织中存在NLRP1的高丰度表达，故以人源永生化的角质细胞N/TERT-1为模型，研究NLRP1对病毒感染的响应。已有研究发现DDP8/9抑制剂VbP可激活NLRP1炎症小体【7】。在N/TERT-1细胞内敲除NLRP1和ASC等炎症小体成员后，VbP处理发现IL-1beta活化明显减少。而使用病毒为感染模型，则发现RNA病毒SFV（semliki forrest virus）可以活化N/TERT-1细胞IL-1beta，而DNA病毒不能，且该效应依赖NLRP1和ASC，提示NLRP1可能参与RNA病毒感染过程。有意思的是，N/TERT-1细胞对能激活NLRP3、NLRC4活化的信号则没有响应，说明在皮肤组织内，可能仅保留了NLRP1介导的炎症小体通路。

研究人员继续以poly(I:C)模拟RNA病毒感染，发现也可以引起由NLRP1依赖的IL-1beta活化，且敲除NLRP1后明显减少Caspase-1活化和细胞焦亡，且不影响干扰素通路。

研究人员试图验证鼠源Nlrp1蛋白对RNA病毒感染的效应。意外的是，在NLRP1缺失N/TERT-1细胞内回补了鼠源Nlrp1b，仍可以对VbP发生响应，但poly(I:C)无法活化由鼠源Nlrp1b介导的炎症小体活化，即鼠源Nlrp1b不响应RNA病毒感染。此外，N端降解功能的抑制剂Me-Bs不能抑制poly(I:C)引起的炎症小体活化。这些结果提示NLRP1在上皮组织内识别RNA感染的功能具有种属和组织特异性。

至此，关于功能部分，研究人员已经完成比较清晰的论证。在机制上，研究人员分析推测人源NLRP1的N端结构可以识别病毒核酸序列，并通过Pull-down实验，证实NLRP1可以直接结合dsRNA和dsDNA（Kd值为241.7nM和336.7nM）。通过截短体验证LRR结构域负责结合dsRNA和dsDNA，NACHT结构可以增强其结合效应。而鼠源的Nlrp1b蛋白则不能结合dsRNA和dsDNA。通过模拟分析，研究人员推测LRR结构域表面呈正电的氨基酸负责了与核苷酸的识别。

既往已经发现的多种核酸结合蛋白均可以体外结合dsRNA和dsDNA，但这种结合并不一定能在功能上活化下游通路。研究人员进一步发现，NACHT结构域具有ATP水解酶活性，当LRR结合dsRNA后，NACHT可以水解ATP后引起蛋白构象改变从而完成NLRP1的活化，而dsDNA则没有这种效应。

本研究给NLRP1的功能和机制的研究增加了很多新鲜的内容：1）首先在功能上，这项工作首次发现NLRP1可以响应RNA病毒的感染，这种功能与NLRP1响应炭疽LF因子不同：LF通过N端降解功能水解出C端的CARD，直接结合Caspase-1组成炎症小体，而RNA病毒感染则是通过结合LRR和NACHT结构域，依赖于ASC组装炎症小体。这项发现补充了NLRP1结构域上的新功能，并证实这是两套相对独立的识别病原体途径。2）其次，NLRP1具有RNA结合功能，是新证实的胞质内RNA病毒感受器。既往的炎症小体上游感受器仅发现AIM2可识别DNA病毒和胞内菌DNA序列，该发现补充了炎症小体在RNA病毒感染中的空白。3）最后，NLRP1的这个新功能仅在人源上皮组织中验证出来，提示这是人类对RNA病毒在皮肤这道屏障中的特殊响应功能，而小鼠的Nlrp1b蛋白则不具有该功能。

本研究工作在解析NLRP1的新功能之余也留了太多未解决的问题。虽然研究人员试图证明NLRP1具有结合dsRNA和水解ATP的活性，但仍缺少直接的生化基础和结构分析证明其功能。虽然NLRP1炎症小体参与RNA病毒感染免疫具有足够的新意，但因为小鼠同源蛋白缺失该功能，本研究缺少足够的体内实验证据，且关于该功能的起源和分子进化仍需要进一步研究讨论。

参考文献：

[1]BROZ P, DIXIT V M. Inflammasomes: Mechanism of Assembly, Regulation and Signalling[J]. Nature Reviews Immunology, 2016, 16(7): 407–420. DOI:10.1038/nri.2016.58.

[2]MARTINON F, BURNS K, TSCHOPP J. The Inflammasome: A Molecular Platform Triggering Activation of Inflammatory Caspases and Processing of ProIL-Beta[J]. Molecular Cell, 2002, 10(2): 417–426. DOI:10.1016/s1097-2765(02)00599-3.

[3]VAN OPDENBOSCH N, GURUNG P, VANDE WALLE L, 等. Activation of the NLRP1b Inflammasome Independently of ASC-Mediated Caspase-1 Autoproteolysis and Speck Formation[J]. Nature Communications, 2014, 5(1): 3209. DOI:10.1038/ncomms4209.

[4]SANDSTROM A, MITCHELL P S, GOERS L, 等. Functional Degradation: A Mechanism of NLRP1 Inflammasome Activation by Diverse Pathogen Enzymes[J]. Science, 2019, 364(6435): eaau1330. DOI:10.1126/science.aau1330.

[5]CHUI A J, OKONDO M C, RAO S D, 等. N-Terminal Degradation Activates the NLRP1B Inflammasome[J]. Science, 2019, 364(6435): 82–85. DOI:10.1126/science.aau1208.

[6]ROBINSON K S, TEO D E T, TAN K S, 等. Enteroviral 3C Protease Activates the Human NLRP1 Inflammasome in Airway Epithelia[J]. Science (New York, N.Y.), 2020. DOI:10.1126/science.aay2002.

[7]ZHONG F L, ROBINSON K, TEO D E T, 等. Human DPP9 Represses NLRP1 Inflammasome and Protects against Autoinflammatory Diseases via Both Peptidase Activity and FIIND Domain Binding[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2018, 293(49): 18864–18878. DOI:10.1074/jbc.RA118.004350.

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