Fluo-3, AM是最常用的检测细胞内钙离子浓度的荧光探针之一。它穿透细胞膜 进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成 Fluo-3 ，从而被滞留在细胞内，Fluo-3 若以游离配体形式存在 时几乎是非荧光性的，但是当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，最大激发波长为 506nm ，最大发射波长为 526nm 。实际检测时推荐使用的激发波长为 488nm 左右，发射波长为 525～530nm 。可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。 

使用方法（仅供参考）： 

1. 用 HBSS 稀释 Fluo-3, AM 溶液，制备 4-5µM 的 Fluo-3, AM 工作液。 

2. 将 Fluo-3, AM 工作液加入细胞，在 37℃培养 20 分钟。

3. 加入 5 倍体积的含有 1%胎牛血清的 HBSS，再继续培养 40 分钟。

4. 用 HEPES buffer saline 洗涤细胞 3 次，然后用 HEPES buffer saline 使细胞重悬浮，制成 1×105 cells/mL 的溶液。

5. 37℃下培养 10 分钟，然后用该细胞进行荧光钙离子检测。激发波长 506nm，发射波长 526nm。

   *标记的条件因细胞种类而异，在每次实验前，请先确定最佳条件。

   注意事项： 1、 如果使用含有血清的培养基，血清中的脂酶会分解 AM 体，从而降低 Fluo-3, AM 进入细胞的效 果。

                     2、含有酚红的培养基会使本底值略微偏高，所以加工作液之前，应该尽量去除培养基 残留。

                     3、 Pluronic F127 可以防止 Fluo-3,AM 在 HBSS 中聚合并能够帮助其进入细胞。故，可以向 Fluo-3,AM溶液中加入适量的 Pluronic F127 溶液，不建议在 Pluronic F127 中长期保存 Fluo-3,AM 溶液。

                     4、荧光染料均存在萃灭问题，请注意避光，以减缓荧光萃灭。