人和小鼠表面抗原密度及其测量方法

表面抗原密度

细胞携带的抗原或靶分子的数量与阳性群的强度直接相关, 并将决定与其匹配的最佳荧光素。

将荧光强度低的荧光素与高表达抗原配对, 将荧光强度强高的荧光素与低丰度抗原配对, 可以提高细胞群体的分辨率, 但是如何得知抗原密度呢？

本指南列出了一些常见的人和小鼠细胞表面标记物的抗原密度, 以帮助您选择正确的荧光素。另外提供了如何使用抗体结合珠测量抗原密度的方法。

常见人标记物的抗原密度

新鲜分离的外周血细胞表面发现的常见标记物的抗原密度。

图 1.21 种常见人类标记的数据。获得每个表面标记物的几何平均荧光强度，并将其转换为抗原密度, 并以对数刻度绘制。图中结果来自于正常人外周血的 4 次独立实验结果。在 Bio-Rad ZE5 流式细胞分析仪上获取数据并在 FlowJo 中进行结果分析。

荧光素亮度

本示例说明了 CD4 与更亮荧光素（PE）配对可以提高分辨率。

图 2. 荧光素的相对亮度。外周血 CD4 染色的示例显示了 3 种荧光团从暗（Pacific Blue）到亮（PE）的相对亮度。显示的数据是在 Bio-Rad ZE5 流式细胞分析仪上获得的。

常见小鼠标记物的抗原密度

C57BL/6 小鼠的新鲜分离的脾脏细胞表面的常见标记物的抗原密度。

图 3.16 种常见小鼠标记物的数据。获得每个表面标记物的几何平均荧光强度, 并将其转换为抗原密度, 并以对数刻度绘制。图中数据来自于 C57Bl/6 小鼠的 3 次独立实验的结果。在 Bio-Rad ZE5 流式细胞分析仪上获取数据并在 FlowJo 中进行结果分析。

荧光素配对

为了获得最佳结果, 应将低密度抗原与明亮的荧光素配对, 将高密度抗原与较暗的荧光素配对。

图 4. 染色示例。 A, 人外周血单核细胞用 CD14 A700 和 CD163 A488 染色。B, 小鼠骨髓细胞用CD11b PB 和 GR-1 FITC 染色。在 Bio-Rad ZE5 流式细胞分析仪上获取数据。

星光染料分类	已上市和待上市染料
StarBright Blue  （488 nm）	SBB510,SBB575, SBB610,SBB670, SBB700,SBB750, SBB780
StarBright Violet  （405 nm）	SBV440,SBV475, SBV515,SBV570, SBV610,SBV670, SBV710,SBV760, SBV790
StarBright UV （355 nm）	SBUV400,SBUV445, SBUV510,SBUV575,  SBUV605,SBUV665,   SBUV750,SBUV795

全新流式染料星光系列：更亮的亮度, 更窄的发射波普, 缓冲液兼容性好, 染色一致性好（具体见上表）。

四个简单步骤测量抗原密度

Quantum 系列校准微球有 FITC 和 PE 两种荧光标记可选根据对应的检测抗体的荧光素来选择, 微球大小近似于人类淋巴细胞, 中级强度的试剂盒可以很好地涵盖典型细胞样品的范围。结合标准曲线, 可以计算待检测抗原的密度。该种方法也可用于确定流式细胞仪线性度。

1、滴定抗体

通过合适的抗体浓度找到最佳的染色指数。

2、微球染色

确保微球的量是饱和的。珠子的荧光强度随着抗体结合能力 ( ABC ) 而增强。

3、创建标准曲线

使用半高/全宽门测量几何平均值, 创建针对抗体结合能力的荧光标准曲线。

4、测量抗原密度

使用阳性群体的几何平均荧光强度, 可以计算感兴趣细胞上任何抗原的密度。

Bio-Rad 于 2013 年 1 月收购了知名抗体公司 AbD Serotec。该公司成立于 1982 年, 总部位于英国牛津。提供上万种抗体和免疫学试剂、单抗制备和多种规模的抗体生产和标记服务。其宗旨为生产高质量的抗体和免疫学试剂。该公司拥有最具特色的大鼠 CD68 单抗（克隆号: ED1）; 抑制素 A 检测试剂盒为专利产品; 将 SpyTag 技术引入 HuCAL 平台, 提供非动物来源的抗体定制服务。

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