利用活性α突触核蛋白构建帕金森动物模型

       帕金森是第二大老龄化相关的神经衰退疾病。主要的生物化学改变为神经元中产生不溶性“路易小体”，其主要的成分是聚集的α突触核蛋白。α突触核蛋白在神经衰退类疾病中扮演着重要角色，如路易体痴呆，多系统萎缩症和帕金森，这些疾病统称为突触核蛋白病。在这些疾病中，α突触核蛋白集合形成更大的聚合体，也就是路易体和营养障碍性神经突。α-突触核蛋白是高度易溶的，没有内部结构的小分子蛋白，广泛存在于大脑中，主要分布于神经元突触前体内。α突触核蛋白参与突触小泡的信号分子释放，包括多巴胺，对机体运动非常重要。α突触核蛋白寡聚体（oligomers）具有神经毒性，能以类似朊病毒的方式扩散致病。

       α突触核蛋白是一种分子量为14KD的蛋白，主要存在于中脑黑质中的神经元突触前体，目前还不能完全了解其功能。α突触核蛋白的非淀粉样蛋白部分，又称NAC 区域，由中段憎水区构成，是形成蛋白聚集的必要区域。α突触核蛋白单体可以形成各种类型的寡聚体。随着寡聚体形成可溶性原纤维或纤维细丝，蛋白聚集也在持续进行。纤维细丝经过结构变化，从α螺旋结构变成β折叠，然后形成不溶性纤维。这些各种类型的蛋白以动态平衡的形式同时存在。

       StressMarq公司是神经衰退疾病研究工具行业的领先制造商，是活性α突触核蛋白单体，寡聚体，前体原纤维的生产商。前体原纤维，又称PFF。PFF是制作帕金森疾病模型的重要工具，它们可以大大加速α突触核蛋白单体的聚集。

       在体外通过硫磺素T作为指示剂，当蛋白聚集时形成β折叠时，可以看到增强的荧光信号，这是蛋白聚集的一种固有现象。将PFF加入到原代神经元中或者注射到啮齿动物大脑中，都可造成蛋白聚集和α突触核蛋白病理现象。路易体病理现象从注射点开始蔓延，可用129号位丝氨酸磷酸化的抗体来识别，这是可视化α突触核蛋白病理现象的最佳方法。将 PFF注射到动物脑中制作病理模型，比使用基因改造模型要快10到15倍。该方法制作疾病模型的时间要远远短于传统的基因改造小鼠、大鼠。通常注射后30天即可见到病理反应，而基因改造模型需要9个月到1年时间。为帕金森造模提供了极大的便利。α突触核蛋白PFF还可以结合荧光标记， 用于蛋白示踪。虽然路易体病理现象是突触核蛋白病的最先出现的症状, 但是α突触核蛋白寡聚体在疾病进程中也扮演重要角色，因为它们有很强的神经毒性。α突触核蛋白可以被稳定在寡聚体形式，加入到疾病模型中诱发毒性。

       StressMarq的α突触核蛋白产品线包括原纤维，寡聚体和抗体，可以用于研究α突触核蛋白的病理学和毒性特征。这给科研学者提供了有力的工具，用来构建疾病模型，检测新药，一起攻克神经衰退疾病治愈难题。

       StressMarq目前提供人源和小鼠源前体原纤维（PFFs）以及单体用于帕金森造模的研究。所有蛋白都进行了细胞检测和ThT检测。TEM 图片、ThT检测曲线以及其他检测结果可以在产品单页上看到。A53T α-突触核蛋白单体和PFFs也上线了。A53T突变型被认为与早发型帕金森疾病有关并且加速α-突触核蛋白的纤维聚化。

       大鼠原代海马神经元经过 1 型 小鼠α-突触核蛋白PFFs处理后显示出路易小体病理现象。

       大鼠脑注射了1型小鼠α-突触核蛋白 PFFs (SPR-324) 后的IHC分析，显示了α-突触核蛋白病理现象.

       StressMarq目前正在研发更多的原纤维新品用于神经衰退疾病研究，并且也在完善我们现有的产品线。下面表格列出了各种蛋白的区别：

	1型PFFs(SPR-322)	1型PFFs(SPR-324)	1型PFFs(SPR-326)	2型PFFs(SPR-317)	3型PFFs(SPR-448)	蛋白纤维(SPR-450)
物种来源	人	小鼠	人	人	人	人
突变类型	野生型	野生型	A53T	野生型	野生型	野生型
单体来源	SPR-321	SPR-323	SPR-325	SPR-316	SPR-316	SPR-321
内毒素水平	制作时含有内毒素LPS, 并且没有移除	制作时含有内毒素LPS, 并且没有移除	制作时含有内毒素LPS, 并且没有移除	纤维聚集之前移除了LPS (低内毒素)	纤维聚集之前移除了LPS (低内毒素)	制作时含有内毒素LPS, 并且没有移除
ThT 检测	与SPR-321 单体混合时荧光强度>12 000 荧光单位 与 SPR-316 单体混合时荧光强度为1300 荧光强度	与SPR-323单体混合时荧光强度> 3100 荧光单位	与SPR-325单体混合时有28 000 荧光单位	与SPR-321单体混合时有3000荧光单位 与SPR-316 单体混合时有400荧光单位	调研中	调研中
原代细胞活性	在原代大鼠细胞中会诱发路易体病理现象	在原代大鼠细胞中会诱发路易体病理现象	调研中	在原代大鼠细胞中不会诱发路易体病理现象	调研中	调研中
活体内活性	在大鼠大脑中注射后30天内产生病理反应	在大鼠大脑中注射后30天内产生病理反应	调研中	调研中	调研中	调研中

       3型PFFs (使用新型支架制作) 与1 型 PFFs 结构和活性都相似，但是内毒素水平较低与2 型 PFFs 相似。 PFFs 不可溶而蛋白纤维可溶，但是可能根据操作手法不同会有少量不溶原纤维。抑制剂可以停滞alpha突触核蛋白的聚集，阻止寡聚体形成原纤维。以下是抑制剂阻滞的寡聚体:

	盐酸多巴胺处理的寡聚体 (SPR-466)	黄芩苷元处理的寡聚体 (SPR-467)	EGCG 处理的寡聚体 (SPR-469)
抑制剂	盐酸多巴胺 (Dopamine HCl)	黄芩苷元 (Baicalein)	表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG)
物种来源	人	人	人
突变类型	野生型	野生型	野生型
单体来源	SPR-321	SPR-321	SPR-321
内毒素	制作时含有内毒素LPS, 并且没有移除	制作时含有内毒素LPS, 并且没有移除	制作时含有内毒素LPS, 并且没有移除

       只含有抑制剂-阻滞的寡聚体的ThT检测在24小时内没有显示荧光强度增强，当与1型单体混合时荧光强度有所增加。 但是这个增加比单独1型单体的增加要少。这说明这些抑制剂-阻滞的寡聚体减缓了单体的聚集。

       ThT是一种荧光染料，可以绑定富含beta折叠的结构, 例如alpha 突触核蛋白原纤维. 抑制剂介入-盐酸多巴胺处理的寡聚体(SPR-466)显示的荧光强度和单体(SPR-321)相比要少得多。单体和抑制剂介入的寡聚体混合后显示的聚集作用很有限。

      大鼠活体注射帕金森建模和检测实验

       该实验操作指南是将1型小鼠PFFs(SPR-324)或1型人PFFs(SPR-322)注射到大鼠脑中来产生alpha突触核蛋白病理特征。小鼠PFFs显示出了更强的聚集效果。

使用的动物: 雌性 SD(Sprague Dawley) 大鼠

      2uLPFFs或者单体 (阴性对照) 通过以下两个脑顶叶区的位置注射：

      ● AP+1.6,ML+2.4,DV–4.2

      ● AP–1.4,ML+0.2,DV–2.8

      30天后, 用生理盐水灌注大鼠然后在大鼠脑冠状平面切开，将中脑与前脑分开。之后两部分都用4%PFA 固定48小时。

 

      DAB 操作步骤

      材料

      ● 1XTBS (含有和不含有TX-100的)

      ● 30% H₂O₂

      ● 柠檬酸缓冲液

      ● 驴血清(保存在-20℃;冻融稳定的)

      ● 一抗：pSYN EP1536Y (Abcam; ab51253)

      ● 二抗：生物素-SP (long spacer) AffiniPure 驴抗兔 IgG (H+L) (Jackson Immuno; 货号: 711-065-152)

      ● ABC 试剂 (Vector; 货号: PK-7100)

      ● DAB 试剂 (Vector; 货号: SK-4100)

      ● 孔板 (规格取决于要染色的区域数量)

      ● 漆刷

      ● 玻璃钩

      ● 漂白剂

      ● ddH20

      ● BD Luer-lock 注射器 10 mL

      ● 过滤器 0.22 uM 孔径 (Fisher 货号. SLMP025SS)

      ● 100% EtOH

      ● Histoclear (用于清理组织)

      ● 显微镜载玻片和盖玻片

      ● Permount (封片剂)

 

      第一天：(猝灭, 抗原修复, 阻断, 一抗)

      → 用 1X TBS (震荡, 室温)冲洗切片 5 次以除去冷冻保护剂。

      → 把切片放到 0.6% H2O2 的 TBS 中，覆盖好，置于操作台 20 分钟。

      *该步骤不要用 MESH WELLS*

      用 _______ mL TBS, _______ uL 30% H2O2

      → 用 1X TBS (震荡, 室温) 冲洗切片 3 次。

      → 做抗原修复时, 提前在水浴中预热柠檬酸缓冲液至少 15~30 分钟。在柠檬酸缓冲液中培养切片一小时，将温度设置为 37℃，不要震荡 。

      → 用 1X TBS (震荡, 室温) 冲洗切片 3 次。

      → 阻断时, 将切片置于 5% 常规驴血清和 0.25% Triton-100 的 TBS 中阻断 1 小时，冷室、震荡。

      *注意: 可以使用含有 Triton 的 TBS 阻断液 (1 L TBS, 2.5 mL TX-100), 之后只需要向阻断液中加入驴血清来阻断。*

      用 _______ mL TBS,

      _______ uL 驴血清, _______ uL 10% TX-100

      → 用 1X TBS (震荡, 室温) 冲洗切片 3 次。

      → 用含 5% 驴血清的 TBS 制备一抗溶液，稀释度为 1：5000。用锡纸包好切片，和抗体一起在冷室中震荡培养过夜。

      用 _______ mL TBS,

      _______ uL 驴血清, _______ uL pSYN EP1536Y

 

      第二天：(二抗, ABC 扩大信号, DAB 染色)

      → 用 1X TBST (震荡，室温) 冲洗切片 3 次. 余下的步骤中，需要一直将切片保留在锡纸里，即使是冲洗的步骤。

      → 用含 5% 驴血清的 TBS 制备二抗溶液，稀释度为 1：500。在冷室中培锡纸养盖好的切片 2 小时，震荡。

      用 ______mL TBS,

      ______ uL 驴血清, _______ uL 生物素标记的驴抗兔 IgG

      → 用 1X TBST (震荡，室温) 冲洗切片 3 次。

      → 用 ABC 试剂培养切片 30 分钟 (震荡, 冷室)。

      → 用 1X TBS 冲洗切片 3 次 (震荡，室温)。

      → 用 falcon 离心管和 ddH2O 制备 DAB 溶液，每 5 mL H2O 加入如下溶液然后涡旋混合:

      2滴缓冲溶液

      4滴 DAB 溶液

      2滴过氧化氢溶液

      *注意: 所有接触过DAB 的器具只能用来操作 DAB。我们还在通风橱内准备了一个 DAB 专用的废液缸。使用玻璃钩来处理 DAB 溶液中的切片而不能用漆刷，并且操作后要用漂白剂冲洗玻璃钩。盛装过 DAB 的器皿都需要用漂白剂冲洗并且处理到生物性危害箱中。*

      → 用注射器过滤到新的6孔板中。每一个需要染色的脑切片都用一个新的 DAB 孔。

      → 在DAB中培养每个切片直到变为浅棕色(2-3分钟就足够; 时间太长可能会造成背景染色太多)

      → 用 ddH2O冲洗3次

      → 在 1X TBS 中封片，然后在切片柜中干燥过夜。

 

      第三天：(脱水和盖玻片)

      *注意: 在开始脱水步骤之前，确保浸片用的玻璃皿里有足够的液体可以盖过切片上的所有组织。*

      → 按照如下顺序和时间脱水切片：

      1.30秒ddH20

      2.3分钟70% EtOH

      3.3分钟95% EtOH

      4.3分钟95% EtOH

      5.3分钟100% EtOH

      6.3分钟100% EtOH

      *置于振荡器*

      7.5分钟 Histoclear

      8.5分钟 Histoclear

      9.5分钟 Histoclear

      → 将切片从切片篮从取出，一次一片，置于吸水纸上。

      → 加封片剂时，取一个 P1000 移液器和吸头，将吸头尖剪掉，容量设到 400 到 500 μL.

      → 连续滴几滴封片剂 Permount 到切片的中间，倾斜切片使封片剂完全覆盖切片。

      → 用棉棒的木头一端赶出切片中的气泡。

      → 将切片放在吸水纸上，置于操作台上过夜晾干。

      *注意: ~24 小时之后, 多余的 Permount 封片剂应该用 Histoclear 移除*

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