ELISA实验常见问题及解答

ELISA实验常见问题及解答

阳性对照偏低或低吸光度
原因 解决方案
试剂未平衡至室温 ● 实验开始前,将试剂盒从冰箱取出平衡至室温
检测体积偏小 ● 确保取液时,正确使用移液器
● 
检查移液器吸液管道是否阻塞
● 
校正移液器
孵育时间过短 ● 使用计时器,准确孵育时间
底物受污染 ● 使用新配制的试剂,重新实验
包装袋中有湿气 ● 检查袋中是否有干燥剂
● 
封好未使用的孔条
● 
首次开袋时,应标上日期
样本中有抑制剂 ● 叠氮钠会抑制 HRP 酶的活性
洗涤步骤过于剧烈 ● 降低洗涤系统的压力
试剂在使用前未混匀 ● 使用前务必混匀试剂
实验开始前微孔变干燥 ● 实验过程勿中断,需连续完成所有实验步骤
未加终止液 ● 加入终止液,增强颜色反应的强度,稳定最终的颜色反应
结合物工作液浓度偏低 ● 准确稀释制备工作液,按说明书建议操作
读数时使用的滤光片不正确 ● 使用 TMB 底物时,450nm 波长下读数,650nm 波长下读取校正读数
标准曲线良好但样本无检测信号
原因 解决方案
样本中无待检物 ● 设置对照,重新实验
样本中其他物质影响或掩盖检测 ● 作适当稀释,降低其他物质干扰或作系列稀释 , 检测回收率
样本中检测物过高 , Hook 效应导致假阴性 ● 适当倍数稀释样本,检测物浓度尽量在检测试剂盒检测范围内
假阳性反应
原因 解决方案
洗涤不充分 ● 使用前须检查洗板机是否正常工作
洗板机管道阻塞 ● 须经常维护洗板机
微孔板受酶结合物污染
加结合物时 , 洒在微孔边缘
结合物污染了底物溶液
● 小心向微孔加入结合物,加入微孔底部中央,避免与孔壁和边缘接触
检测样本中含有红细胞 ● 离心
微孔中液体挥发 ● 用封板胶密封反应孔 , 置于湿盒内
结合物工作液浓度过高 ● 按说明书稀释
孵育温度过高 ● 降低温度
重复性较差
原因 解决方案
微孔中有小气泡 ● 用针尖挠破气泡
分液误差 ● 检查分液装置
试剂未混匀 ● 确保充分混匀试剂
洗涤不充分 ● 确保所有微孔都抽吸干净,并及时填满微孔
微孔被吸头划破 ● 洗液或注液时,小心操作
样本中有杂质或沉淀物 ● 使用前须离心
孵育温度不稳定 ● 在温度稳定的孵育箱中进行孵育
使用了用过的封板胶纸 ● 每次须使用新的封板胶纸封闭反应孔
高背景或阴性对照值偏高
原因 解决方案
阴性对照孔被阳性对照或样本污染 ● 洗涤时,勿将洗液溢出板孔外
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确保洗涤时每个孔都充满缓冲液,洗涤后确保将残余液体从孔中移除
● 
在微孔中央吸取样本或试剂时,避免枪头与内壁或边缘接触
● 
重新洗涤
抗体非特异性结合 ● 封闭液不适合,更换封闭液
● 
预处理微孔以防止抗体非特异性结合
酶结合物浓度过高 ● 检查浓缩酶结合物是否按照说明书要求正确稀释
孵育温度过高 ● 抗体在适当温度下具有最适结合活性,确保孵育在说明书指定温度下进行
缓冲液被污染 ● 准备新的缓冲液,进行灭菌过滤
孵育时间过长 ● 按说明书规定时间孵育,或缩短孵育的时间
底物在使用前曝光 ● 应避光保存于暗处
读板前停留时间过长 ● 加终止液后 3 分钟内读数
读数时使用的滤光片不正确 ● 检查滤光片, TMB 底物推荐在 450nm 下读数
未加入终止液 ● 如底物反应未终止,颜色会继续生成
标准曲线不佳
原因 解决方案
倍比系列稀释标准品时,未混匀 ● 加入标准品和稀释液后,须混匀
过早稀释 ● 在刚要使用时,准备试剂立即加入微孔
洗涤不充分 ● 确保所有微孔都抽吸干净,并及时填满微孔
读数时间超出了显色所需时间 ● 读数时间在说明书推荐的时间内,注意观察颜色变化
体积不正确 ● 校正移液器
移液器使用不当 ● 快速等量地将吸液管中的液体分配到各微孔中,使用校正过的移液器
整块板产生阳性 OD 值或整个板显蓝色
原因 解决方案
洗涤液体积不足或底物被残留于孔低的结合物所污染 ● 洗涤时,缓冲液充满至孔边缘,但要确保不能溢出孔外
结合物浓度过高 ● 检查是否按照说明书推荐比例稀释
血清中有血清因子 ● 勿加热血清
底物容器不洁净 ● 用酸清洗容器瓶,用蒸馏水冲洗
底物孵育时,微孔板曝光 ● 加底物时,立即将板置于暗处
整块板 OD 值偏低
原因 解决方案
显色时间不足 ● 适当延长显色时间
孵育温度偏低 ● 36 度为最适反应温度 ( 金畔 ELISA 试剂盒 )
未加终止液 ● 加入终止液,增强颜色反应的强度,稳定最终的颜色反应
部分原因也可参考【阳性对照偏低或低吸光度】
显色缓慢
原因 解决方案
样本未置于室温 ● 实验开始前,将样本平衡至室温
酶结合物活性减弱 ● 检测稀释度
酶活性受到抑制如叠氮钠 ● 避免使用不当的防腐剂
显色温度不适当 ● 按说明书操作
边缘效应
原因 解决方案
蒸发 ● 各操作步骤间,须使用封板胶密封反应板
温度不均匀 ● 在孵育时,将板放于 36 ℃孵育箱中,避免温度波动。勿叠放反应板防止受热不均

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