ELISA实验常见问题及解答
| 阳性对照偏低或低吸光度 | |
| 原因 | 解决方案 |
| 试剂未平衡至室温 | ● 实验开始前，将试剂盒从冰箱取出平衡至室温 |
| 检测体积偏小 | ● 确保取液时，正确使用移液器 ● 检查移液器吸液管道是否阻塞 ● 校正移液器 |
| 孵育时间过短 | ● 使用计时器，准确孵育时间 |
| 底物受污染 | ● 使用新配制的试剂，重新实验 |
| 包装袋中有湿气 | ● 检查袋中是否有干燥剂 ● 封好未使用的孔条 ● 首次开袋时，应标上日期 |
| 样本中有抑制剂 | ● 叠氮钠会抑制 HRP 酶的活性 |
| 洗涤步骤过于剧烈 | ● 降低洗涤系统的压力 |
| 试剂在使用前未混匀 | ● 使用前务必混匀试剂 |
| 实验开始前, 微孔变干燥 | ● 实验过程勿中断，需连续完成所有实验步骤 |
| 未加终止液 | ● 加入终止液，增强颜色反应的强度，稳定最终的颜色反应 |
| 结合物工作液浓度偏低 | ● 准确稀释制备工作液，按说明书建议操作 |
| 读数时使用的滤光片不正确 | ● 使用 TMB 底物时，450nm 波长下读数，650nm 波长下读取校正读数 |
| 标准曲线良好但样本无检测信号 | |
| 原因 | 解决方案 |
| 样本中无待检物 | ● 设置对照，重新实验 |
| 样本中其他物质影响或掩盖检测 | ● 作适当稀释，降低其他物质干扰或作系列稀释 , 检测回收率 |
| 样本中检测物过高 , Hook 效应导致假阴性 | ● 适当倍数稀释样本，检测物浓度尽量在检测试剂盒检测范围内 |
| 假阳性反应 | |
| 原因 | 解决方案 |
| 洗涤不充分 | ● 使用前须检查洗板机是否正常工作 |
| 洗板机管道阻塞 | ● 须经常维护洗板机 |
| 微孔板受酶结合物污染 加结合物时 , 洒在微孔边缘 结合物污染了底物溶液 |
● 小心向微孔加入结合物，加入微孔底部中央，避免与孔壁和边缘接触 |
| 检测样本中含有红细胞 | ● 离心 |
| 微孔中液体挥发 | ● 用封板胶密封反应孔 , 置于湿盒内 |
| 结合物工作液浓度过高 | ● 按说明书稀释 |
| 孵育温度过高 | ● 降低温度 |
| 重复性较差 | |
| 原因 | 解决方案 |
| 微孔中有小气泡 | ● 用针尖挠破气泡 |
| 分液误差 | ● 检查分液装置 |
| 试剂未混匀 | ● 确保充分混匀试剂 |
| 洗涤不充分 | ● 确保所有微孔都抽吸干净，并及时填满微孔 |
| 微孔被吸头划破 | ● 洗液或注液时，小心操作 |
| 样本中有杂质或沉淀物 | ● 使用前须离心 |
| 孵育温度不稳定 | ● 在温度稳定的孵育箱中进行孵育 |
| 使用了用过的封板胶纸 | ● 每次须使用新的封板胶纸封闭反应孔 |
| 高背景或阴性对照值偏高 | |
| 原因 | 解决方案 |
| 阴性对照孔被阳性对照或样本污染 | ● 洗涤时，勿将洗液溢出板孔外 ● 确保洗涤时每个孔都充满缓冲液，洗涤后确保将残余液体从孔中移除 ● 在微孔中央吸取样本或试剂时，避免枪头与内壁或边缘接触 ● 重新洗涤 |
| 抗体非特异性结合 | ● 封闭液不适合，更换封闭液 ● 预处理微孔以防止抗体非特异性结合 |
| 酶结合物浓度过高 | ● 检查浓缩酶结合物是否按照说明书要求正确稀释 |
| 孵育温度过高 | ● 抗体在适当温度下具有最适结合活性，确保孵育在说明书指定温度下进行 |
| 缓冲液被污染 | ● 准备新的缓冲液，进行灭菌过滤 |
| 孵育时间过长 | ● 按说明书规定时间孵育，或缩短孵育的时间 |
| 底物在使用前曝光 | ● 应避光保存于暗处 |
| 读板前停留时间过长 | ● 加终止液后 3 分钟内读数 |
| 读数时使用的滤光片不正确 | ● 检查滤光片， TMB 底物推荐在 450nm 下读数 |
| 未加入终止液 | ● 如底物反应未终止，颜色会继续生成 |
| 标准曲线不佳 | |
| 原因 | 解决方案 |
| 倍比系列稀释标准品时，未混匀 | ● 加入标准品和稀释液后，须混匀 |
| 过早稀释 | ● 在刚要使用时，准备试剂立即加入微孔 |
| 洗涤不充分 | ● 确保所有微孔都抽吸干净，并及时填满微孔 |
| 读数时间超出了显色所需时间 | ● 读数时间在说明书推荐的时间内，注意观察颜色变化 |
| 体积不正确 | ● 校正移液器 |
| 移液器使用不当 | ● 快速等量地将吸液管中的液体分配到各微孔中，使用校正过的移液器 |
| 整块板产生阳性 OD 值或整个板显蓝色 | |
| 原因 | 解决方案 |
| 洗涤液体积不足或底物被残留于孔低的结合物所污染 | ● 洗涤时，缓冲液充满至孔边缘，但要确保不能溢出孔外 |
| 结合物浓度过高 | ● 检查是否按照说明书推荐比例稀释 |
| 血清中有血清因子 | ● 勿加热血清 |
| 底物容器不洁净 | ● 用酸清洗容器瓶，用蒸馏水冲洗 |
| 底物孵育时，微孔板曝光 | ● 加底物时，立即将板置于暗处 |
| 整块板 OD 值偏低 | |
| 原因 | 解决方案 |
| 显色时间不足 | ● 适当延长显色时间 |
| 孵育温度偏低 | ● 36 度为最适反应温度 ( 金畔 ELISA 试剂盒 ) |
| 未加终止液 | ● 加入终止液，增强颜色反应的强度，稳定最终的颜色反应 |
| 部分原因也可参考【阳性对照偏低或低吸光度】 | |
| 显色缓慢 | |
| 原因 | 解决方案 |
| 样本未置于室温 | ● 实验开始前，将样本平衡至室温 |
| 酶结合物活性减弱 | ● 检测稀释度 |
| 酶活性受到抑制如叠氮钠 | ● 避免使用不当的防腐剂 |
| 显色温度不适当 | ● 按说明书操作 |
| 边缘效应 | |
| 原因 | 解决方案 |
| 蒸发 | ● 各操作步骤间，须使用封板胶密封反应板 |
| 温度不均匀 | ● 在孵育时，将板放于 36 ℃孵育箱中，避免温度波动。勿叠放反应板防止受热不均 |
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