ImmPRESS 通用检测试剂在双抗原染色中的应用 (1)
对同一张组织切片上的两种或多种抗原进行免疫组化定位,有多种酶学方法可供选择。概括起来可分为两大类:
用相同的酶系统、不同的酶作用底物对每种抗原进行检测,或用不同的酶系统及其相应的底物,对每种抗原进行检测。
目前Vector公司所提供的可广泛选择的VECTORSTAIN® ABC kit试剂盒及底物试剂盒,上述两种方法都适用。
Vector开发的许多独特的底物尤其适用于多抗原标记。通常,过氧化物酶底物能产生更稳定、更密集的有色沉积物而能对抗原进行精确定位;碱性磷酸酶底物较弥散;葡萄糖氧化酶相比而言灵敏度较低,但当使用高浓度的一抗时,也可作为第二种标记对抗原进行定位。
双抗原染色流程图
双抗原染色实验步骤
1.组织标本制备。脱蜡、水化、抗原修复(可根据一抗说明书推荐方法进行操作)。
2.在蒸馏水中清洗5分钟。
3.如存在内源酶活性,可采用适当方法以消除内源酶的作用。(如3%H2O2-甲醇液中浸泡10分钟,以消除内源性过氧化氢酶的作用)。
4.用PBS洗2 分钟/次×3次(也可使用其他缓冲液)。
5.Avidin/biotin封闭。 如有需要,可进行Avidin/Biotin封闭(Avidin/Biotin 封闭试剂盒,目录号 SP-2001)。在Avidin溶液中孵育15分钟。用缓冲液清洗,然后在Biotin 溶液孵育15分钟。用PBS洗2 分钟/次×3次。如已设置适当对照,背景不需考虑时,也可省去此步。
6.蛋白封闭。用含5%正常血清的缓冲液孵育20分钟。或在10%的正常血清中孵育5-10分钟。
7.一抗。甩去多余封闭液,滴加适当浓度的一抗(5%正常血清稀释– VECTASTAIN® kit),室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。在蒸馏水中清洗5分钟。
8.PBS洗2 分钟/次×3次。
9.二抗。滴加生物素化二抗,孵育30分钟。若孵育5-10分钟,需升高生物素化二抗的浓度。
10.PBS洗2 分钟/次×3次。
11.加入ABC复合物(预先制备的VECTASTAIN® ABC试剂)。孵育30分钟。若孵育5-10分钟,需提高试剂浓度。
12.PBS洗2 分钟/次×3次。
13.底物。用适当的酶底物进行孵育(可在显微镜下观察至显色最佳)。请根据底物试剂盒中推荐的时间做参考。
14.PBS洗2 分钟/次×3次。
15.(此步起,为对第2种抗原进行染色标记)Avidin/biotin封闭。此步可防止第2套标记试剂与第1套标记试剂相互作用。在蒸馏水中清洗5分钟。
16.蛋白封闭。用含5%正常血清的缓冲液孵育20分钟。或在10%的正常血清中孵育5-10分钟。用PBS洗2 分钟/次×3次(也可使用其他缓冲液)。
17.一抗。甩去多余封闭液,滴加适当浓度的一抗(5%正常血清稀释– VECTASTAIN® kit),室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时(或适当孵育时间)。
18.PBS洗2 分钟/次×3次。
19.二抗。滴加生物素化二抗,孵育30分钟。若孵育5-10分钟,需升高生物素化二抗的浓度。
20.加入ABC复合物(根据说明书预先制备的VECTASTAIN® ABC试剂)。孵育30分钟。若孵育5-10分钟,需提高试剂浓度。
21.PBS洗2 分钟/次×3次。
22.底物。用适当的第2种酶底物进行孵育(可在显微镜下观察至显色最佳)。请根据底物试剂盒中推荐的时间做参考。 23.用自来水冲洗5分钟。
24.复染、盐酸酒精分化、封片、镜下观察。
优质免疫化学检测酶底物
Vector公司能提供过氧化物酶底物、碱性磷酸酶底物和葡萄糖氧化酶底物,以及DuoLuX 化学发光或荧光底物。可用于碱性磷酸酶,过氧化物酶和葡萄糖氧化酶。均为浓缩型,试剂盒内包括能配置成300ml工作液所需的所有试剂成分,足以染色3000-6000张片。试剂盒成分稳定,4℃可保存一年。酶底物反应物有可溶性和非可溶性,适合IHC、WB、ISH、ELISA等多种免疫化学检测方法。
酶 |
产品名称(底物) |
目录号 |
规格 |
过氧化物酶 |
DAB substrate kit |
SK-4100 |
1 kit |
DAB Enhancing Solution |
H-2200 |
30ml |
|
VECTOR VIP Substrate |
SK-4600 |
1 kit |
|
VECTOR SG Substrate kit |
SK-4700 |
1 kit |
|
VECTOR NovaRED Substrate kit |
SK-4800 |
1 kit |
|
AEC Substrate Kit |
SK-4200 |
1 kit |
|
TMB Substrate kit |
SK-4400 |
1 kit |
|
4-CN Substrate kit |
SK-4300 |
1 kit |
|
ABTS Substrate kit |
SK-4500 |
1 kit |
|
碱性磷酸酶物 |
VECTOR Red Sustrate kit |
SK-5100 |
1 kit |
VECTOR Blue Substrate kit |
SK-5300 |
1 kit |
|
VECTOR Black Substrate kit |
SK-5200 |
1 kit |
|
BCIP/NBT Substrate kit |
SK-5400 |
1 kit |
|
Levamisole Suolution |
SK-5000 |
18ml |
|
p-Nitrophenylphosphate Substrate |
SK-5900 |
18ml |
|
葡萄糖氧化酶 |
Glucose Oxidase Substrate kit I |
SK-3100 |
1 kit |
Glucose Oxidase Substrate kit II |
SK-3200 |
1 kit |
|
Glucose Oxidase Substrate kit III |
SK-3300 |
1 kit |
|
化学发光底物 |
DuoLuX Substrate(用于过氧化物酶) |
SK-6604 |
200ml |
DuoLuX Substrate(用于碱性磷酸酶) |
SK-6605 |
100ml |
双色检测底物配对选择指南请询Vectorlabs代理商上海金畔生物科技有限公司。