人外周血单核细胞来源树突状细胞(MoDC)的制备(二)
MoDC的制备
1.外周血单个核细胞的采集
1.1用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80-100ml；
1.2淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC) 。
1.3无血清培养液洗涤2次， 获得纯度在90%以上的PBMC， 细胞数量需达到1-3×10^8。
2.(可选步骤)肿瘤抗原的制备
用于负载DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Ant gens， TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigens， TAA) ， 也可以是肿瘤全细胞抗原。
用TSA或TAA负载的DC具有很好的靶向性， 但该方法具有已确定的肿瘤特异性抗原或抗原肽种类少和单一抗原的免疫攻击经常无法杀伤肿瘤细胞等缺陷。而用肿瘤全细胞抗原负载DC可克服这些缺陷， 因为此时无需知道哪些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA， 而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T淋巴细胞(CTL) 克隆， 从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。
肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。
反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：
2.1手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；
2.2无菌生理盐水洗3次；
2.3用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎， 加入RPMI 1640培养基， 充分研磨；
2.4200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；
2.5用RPMI 1640培养基重悬细胞至1-2×10/ml， 装入5ml无菌冻存管中；
2.6将冻存管浸入液氮中速冻， 10min后取出， 再迅速放入37℃水浴中解冻10min。反复3-5次
注：也可以-80C/37C反复冻融3-5次。
2.7将肿瘤裂解物加入离心管中， 3000rpm， 离心10min；
2.8收集上清，0.22um滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；
2.9-80℃保存备用。
3.DC细胞的培养及鉴定
3.1步骤1中获得的PBMC用无血清培养液调整细胞浓度至2×10°/ml， 置于培养瓶内；
3.237℃，5%CO培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁；
3.3洗去悬浮细胞， 在贴壁细胞中加入含重组人GM-CSF(500-1， 000U/ml) 和重组人IL-4(500U/ml)的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；
3.4每2-3d半量换液一次，并补足细胞因子；
3.5(可选步骤)在培养的第5d，加入步骤2中获得的肿瘤抗原50ug/ml，对DC进行抗原负载；
注：若不对DC进行抗原负载，该步省略。
3.6在培养的第6d， 加入重组人TNF-α(10ng/ml) ， IL-1β(10ng/ml) ， IL-6(1000U/ml) 和PGE 2(1ug/ml) ， 诱导DC细胞成熟；
3.7在培养的第7d或第8d，收获DC细胞，其数量应达到1×10°个以上；
3.8DC的质检：
3.8.1活细胞比例：台盼蓝染色验证活细胞应在90%以上；
3.8.2形态学观察：>90%细胞半悬浮，细胞有多个树突样突起；
3.8.3细胞表型分析(见下图) ：流式细胞术检测DC细胞表面CD 14、HLA-DR、
CD40、CD80、CD83和CD86等分子的表达，成熟的DC不表达CD14，
而高表达其他分子。CD83是成熟DC的特异性标志，在单核细胞和不成熟
DC表面不表达或低表达；
3.8.4无菌检测：收获细胞前取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、
衣原体，均应为阴性；
3.8.5内毒素检测：回输前，用萱试剂检测内毒素含量，标准：内毒素<0.5EU/ml。
DC培养试剂推荐
| 生厂商 | 产品名称 | 产品货号 | 产品规格 | 使用浓度 |
| PeproTech | 重组人GM-CSF(Animal Free) | AF-300-03 | 5μg/20μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg | 50-100ng/ml |
| PeproTech | 重组人IL-4 (nimal Free) | AF-200-04 | 5μg/20μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg | 100ng/ml |
| PeproTech | 重组人TNF-α (nimal Free) | AF-300-01A | 10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg | 10ng/ml |
| PeproTech | 重组人IL-1β (nimal Free) | AF-200-01B | 2μg/10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg | 10ng/ml |
| PeproTech | 重组人IL-6 (nimal Free) | AF-200-06 | 5μg/20μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg | 100ng/ml |
|
PeproTech (BioGems) |
PGE2(前列腺素 E2) | 3632464 | 10mg/50mg | 1ng/ml |
注：Animal Free意为无动物成分。无动物成分的重组细胞因子在生产过程中不会有任何动物源性物质， 尤其是牛的病原体和蛋白的混入，使得最终获得的重组人蛋白中不含任何动物成分。这样可避免动物病原体(如疯牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的机体异种排斥和过敏反应，因此细胞治疗的体外细胞培养过程中最好使用无动物成分的重组细胞因子。
DC鉴定试剂推荐
| 生产商 | 产品名称 | 产品编号 | 克隆号 | 荧光标记 | 规格 |
|
PeproTech (BioGems) |
抗人CD14荧光标记抗体 | 06211 | 61D3 | FITC/PE/APC/Per CP-Cy 5.5 | 25tests/100test |
| 抗人CD40荧光标记抗体 | 02511 | 5C3 | FITC/APC | 25tests/100test | |
| 抗人CD80荧光标记抗体 | 02911 | 2D10.4 | FITC/PE | 25tests/100test | |
| 抗人CD83荧光标记抗体 | 05911 | HB15e | FITC/PE | 25tests/100test | |
| 抗人CD86荧光标记抗体 | 08911 | IT2.2 | PE | 25tests/100test | |
| 抗人HLA-DR荧光标记抗体 | 74111 | LN3 | FITC/PE/APC/Per CP-Cy 5.5 | 25tests/100test |
注：用于DC鉴定的表面标志物的表达在流式图上均呈现单个峰，且多数情况下不能与阴性峰完全区分开来。为避免多色分析时补偿调节不好导致结果的不准确性，建议最好用单标，最多用双标来做DC表面标志的分析，而且必须使用同型对照，而非空白细胞对照来排除背景染色。
参考文献：
[1] Steinman RM， Cohn ZA.Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice.I.Morphology， quantita-tion， tissue distribution.J.Exp.Med.1973； 137(5) ：1142-62.
[2] Bender A， Sap pM， et.al.Improved methods for the generation of dendritic cells from non proliferating progenitors in human blood.J Immunol Methods.1996； 196(2) ：121-35.
[3] Roman iN， Reider D， et.al.Generation of mature dendritic cells from human blood.An improved method with special regard to clinical applicability.J Immunol Methods.1996； 196(2) ：137-51.
[4] Jon u leitH， Ki ihn U， etal.Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions.Eur J Immunol.1997； 27(12) ：3135-42.
[5] Datta J， Terhune JH， etal.Optimizing dendritic cell-based approaches for cancer immunotherapy.Yale J Biol Med.2014；87(4)：491-518.
[6] deJong EC，Vieira PL， etal.Microbial compounds selectively induce Th 1 cell-promoting orTh 2 cell-promoting dendritic cells invitro with diverse th cell-polarizing signals.J Immunol.2002Feb 15； 168(4) ：1704-9.
[7] 张志伟， 宋鑫。DC-CIK细胞临床制备规范化研究。中国肿瘤， 2011； 20(2) ：85-88。
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