TransIT-X2转染试剂

TransIT-X2^® DYNAMIC DELIVERY SYSTEM

高效  — — 完美的广谱转染试剂

实用性广 — — 可以适合用于DNA质粒，siRNA/miRNA以及RNP复合物

科技 — — 非脂质体，阳离子聚合物递送

 

Mirus X2转染系统通过创新的聚合物体系有效地将DNA和RNA从核内体递送到细胞质中，克服了核酸递送的关键障碍。

图1.TransIT-X2^® Dynamic Delivery System可在多种细胞类型中实现较高水平的基因表达

TransIT-X2^® Dynamic Delivery System（Mirus Bio）和Lipofectamine^®2000转染试剂（Thermo Fisher Scientific）试剂与DNA 3:1将编码荧光素酶的质粒DNA转染到41种不同的细胞类型中。使用标准荧光素酶测定法比较转染后24小时的荧光素素酶的表达。在优化比例下实验结果比较表明，使用TransIT-X2^® Dynamic Delivery System（Mirus Bio）在41种细胞类型中的36种细胞中的荧光素酶表达优于或者等于竞争品牌；在17种细胞中TransIT-X2^® Dynamic Delivery System是Lipofectamine^®2000表达水平的2倍，具体细胞在图中用‡表示。

图2. 使用TransIT-X2^® Dynamic Delivery System细胞中GFP表达水平较高

TransIT-X2^® Dynamic Delivery System（Mirus Bio）将编码EGFP的质粒DNA转染到A549、CHO-K1、HepG2、LNCaP、MDCK、PC-12、原代人乳腺上皮细胞（HMEC）和原代正常人真皮成纤维细胞（NHDF）。使用4-8μl TransIT-X2^®（MirusBio）递送2μg DNA。使用Zeiss Axiovert S100在转染后48小时拍照（32X）倒置荧光显微镜 *代表原代细胞。

图3.使用TransIT-X2^® Dynamic Delivery System在多个细胞系和原代细胞中的GFP转染效率较高

使用TransIT-X2^® Dynamic Delivery System（Mirus Bio）将编码EGFP的质粒DNA转染到A549、CHO-K1、Hep G2、MDCK、LNCaP、PC-12、原代人乳腺上皮细胞（HMEC）和原代正常人真皮成纤维细胞（NHDF）中。使用0.2-0.4μl TransIT-X2^® Dynamic Delivery System（Mirus Bio）在96孔板中进行转染，以递送0.1μg DNA（转染试剂：DNA的比率2:1、3:1或4:1）。转染48小时后，用guava^® easyCyte™ 5HT流式细胞仪（MilliporeSigma）对三个孔进行分析。 *代表原代细胞。

图4. 使用TransIT-X2^® Dynamic Delivery System转染质粒DNA和siRNA

使用TransIT-X2^® Dynamic Delivery System（Mirus Bio）将Cy^®5标记的编码核YFP质粒DNA和Cy^®3标记的siRNA转染到HeLa细胞。使用4μL TransIT-X2^® Dynamic Delivery System（Mirus Bio）在6孔板中用聚-L-赖氨酸（PLL）涂层的盖玻片进行转染，以递送2μg DNA（2:1试剂：DNA比）和25 nM siRNA。使用Alexa Fluor^®350 Phalloidin（Thermo Fisher Scientific）对肌动蛋白细胞骨架进行染色。在转染后24小时使用Nikon A1R共焦显微镜拍摄图像（63X）。图像：黄色（核YFP）、蓝色（Cy^®5标记的DNA）、红色（Cy™3标记的siRNA）、绿色（肌动蛋白细胞骨架）。

图5. TransIT-X2^® Dynamic Delivery System比Lipofectamine^®2000具有更高的敲除率

TransIT-X2^® Dynamic Delivery System（Mirus Bio）和Lipofectamine^®2000转染试剂（Thermo Fisher Scientific）用于转染靶向内源性蛋白GAPDH和aha1的siRNA，或在原代正常人真皮成纤维细胞（NHDF）中递送非靶向对照。根据说明书，使用4μl TransIT-X2^® Dynamic Delivery System（Mirus Bio）或6μl Lipofectamine^®2000（Thermo Fisher Scientific）和25nM siRNA在6孔板中转染细胞。使用qRT-PCR测定GAPDH或aha1mRNA相对于18S rRNA水平的量，然后在转染后48小时缩放到阴性对照的mRNA水平。误差条表示孔中的标准偏差。

图6.使用TransIT-X2^® Dynamic Delivery System有效递送miRNA 可降低PTK9 mRNA水平

TransIT-X2^® Dynamic Delivery System（Mirus Bio）和Lipofectamine^®2000转染试剂（Thermo Fisher Scientific）用于转染带有Pre-miR™ hsa-miR-1 miRNA前体（Thermo Fisher Scientific）或mirVana™ miRNA模拟物（Thermo Fisher Scientific）的T47D细胞™。miR-1两者都能降低PTK9 mRNA水平。转染Pre-miR阴性对照以评估基线mRNA水平。根据每个制造商的方案，使用3μl TransIT-X2^®（Mirus Bio）或Lipofectamine^®2000（Thermo Fisher Scientific）和50 nM miRNA在12孔板中转染细胞。使用qRT-PCR测量PTK9 mRNA相对于18S rRNA水平的量，然后在转染后48小时将其换算为阴性对照的mRNA水平。误差条表示复孔的标准偏差。 

TransIT-X2^® Dynamic Delivery System用于CRISPR基因编辑

质粒DNA和gRNA寡核苷酸转染

Cas9蛋白和gRNA都可以由质粒DNA编码用于转染。或者Cas9可以像质粒DNA一样被转染，gRNA可以作为RNA寡核苷酸。

这些方法的优点包括：

● 低成本–质粒DNA是一种可再生、经济高效的格式

● 灵活性-Cas9和gRNA质粒适用于稳定或瞬时转染

● 易于使用-gRNA寡核苷酸格式可将Cas9简单地重新定位到不同的位点

图7.用Cas9质粒DNA和gRNA寡核苷酸进行高效基因组编辑

使用TransIT-X2^® Dynamic Delivery System（24孔板的2µl/孔，Mirus Bio），用0.5µg编码pDNA的Cas9（Millipore Sigma）和50 nM PPIB靶向两部分gRNA（Dharmacon/GE Healthcare）共转染HEK 293T/17、U2OS和NHDF细胞。T7E1错配检测法用于测定转染后48小时的切割效率。

 

Cas9/gRNA核糖核蛋白（RNP）转染

纯化的Cas9蛋白可与gRNA结合，形成RNP复合物，将其递送至细胞，用于快速高效的基因组编辑。

基于RNP的基因组编辑的好处

● 高效转染–将Cas9/gRNA复合物转染至多种细胞类型，包括难以转染的细胞，如免疫细胞和干细胞

● 高特异性–预先形成的RNP复合物提供基因组编辑活动的快速脉冲

● 无DNA-无插入突变风险

图8. TransIT-X2^®在RNP转染方面优于其他试剂

使用TransIT-X2^® Dynamic Delivery System（1µl/孔，Mirus Bio）或Lipofectamine^®CRISPRMAX™ （1.5µl/孔和1µl/孔Lipofectamine^®Cas9 Plus™ 试剂，Thermo Fisher）或Lipofectamine^®RNAiMAX（1.5µl/孔，Thermo Fisher）或Lipofectamine™3000（1.5µl/孔和1µl/孔P3000™ 试剂，Thermo Fisher）将由靶向2部分gRNA（IDT）的PPIB（亲环蛋白B）和Cas9蛋白（PNA Bio）组成的蛋白组成的核糖核蛋白（RNP）复合物递送到（A）HEK 293T/17和（B）U2OS细胞中。根据操作手册，采用24孔板，用6nM Cas9蛋白（PNA Bio）测试不同水平的gRNA（6nM或12nM）。T7E1错配检测法用于测定转染后48小时的切割效率。

图9.用Cas9和gRNA核糖核蛋白复合物在IPS细胞中进行基因组编辑

TransIT-X2^® Dynamic Delivery System用于在人诱导多能干细胞（iPSC）中转染Cas9蛋白/gRNA核糖核蛋白（RNP）复合物。T7E1错配方法用于测定转染后48小时的切割效率。

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