CUTANA™ ChIC / CUT&RUN Kit 快速入门
CUTANA™ ChIC / CUT&RUN Kit 快速入门
Kit v4 – Manual v4.0
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第一天
第一部分：CUT&RUN缓冲液的制备（约30分钟）
1. 按下表所述配制缓冲液。
注意：应根据完整手册附录1.1中的说明，根据细胞类型优化Digitonin（洋地黄皂苷） 的用量。
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缓冲液名称 |
组分 |
1 RXN |
8 RXN |
16 RXN |
保存 |
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Wash Buffer |
Pre-Wash Buffer |
1.8 mL |
14.4 mL |
28.8 mL |
室温，供第一天使用 |
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25× Protease Inhibitor |
72 μL |
576 μL |
1.15 mL |
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1M Spermidine |
0.9 μL |
7.2 μL |
14.4 μL |
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Cell Permeabilization Buffer |
Wash Buffer |
1.4 mL |
11.2 mL |
22.4 mL |
4℃，供第2天使用 |
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5% Digitonin |
2.8 μL |
22.4 μL |
44.8 μL |
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Antibody Buffer |
Cell Perm. Buffer |
100 μL |
800 μL |
1.6 mL |
冰上，供第1天使用 |
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0.5M EDTA |
0.4 μL |
3.2 μL |
6.4 μL |
注意：以下流程皆按单个样本计算，请根据实际样本数量等比例配制
。
第二部分：ConA磁珠活化（约30分钟）
2. 轻轻重悬ConA磁珠，取11 µL至1.5 mL离心管中。
3. 将离心管放在磁力架上，使溶液澄清；用移液器去除上清液。
4. 从磁力架上取下离心管。立即加入100 μL冷的Bead Activation Buffer，并用移液器将磁珠充分重悬。将离心管放回磁力架，使溶液澄清，用移液器去除上清液；此步骤重复一次。
5. 加入11 µL冷的Bead Activation Buffer重悬磁珠。
6. 按照10 µL/管的量，将磁珠等分到8联排管中；置于冰上。
第三部分：细胞与活化磁珠结合（约30分钟）
7. 计数起始细胞并确认其完整性和活力。每样本使用500,000个细胞（可多加10%）。
8. 室温下以600×g的转速离心3分钟，用移液器去除上清液。
9. 用100 µL的Wash Buffer重悬细胞。室温下以600×g的转速离心3分钟，用移液器去除上清液；此步骤重复一次。
10. 用105 µL的Wash Buffer重悬细胞。对制备好的细胞进行计数并检查其完整性。
11. 将 100 µL 细胞转移到含有10 µL 活化 ConA 磁珠的8联排管中。轻轻涡旋重悬，短暂快速离心，将磁珠收集到管底部。
12. 室温孵育10分钟，使细胞吸附到磁珠上。
13. 如果使用多通道移液器，请将试剂槽置于冰上，注入冷的Antibody Buffer。注意：一次取出并更换一条8联排管的缓冲液，以避免 ConA 磁珠变干和样品丢失。
14. 将离心管放在磁力架上，使溶液澄清，用移液器去除上清液。保存10 µL上清液用于台盼蓝染色，以确定上清液中没有细胞（可依据完整手册附录1.2）。
15. 从磁力架上取下离心管。立即加入50µL冷的Antibody Buffer并用移液器吹吸重悬。取 10 µL重悬样品以确认细胞结合到了ConA磁珠上（可依据完整手册附录1.2）。
第四部分：抗体结合（约30min +过夜）
16. 瞬时离心K-MetStat Panel原液并用移液器吹吸混匀（切勿涡旋）。在指定用于H3K4me3和IgG对照抗体的反应中，加入2 µL K-MetStat Panel并涡旋混匀。注意：如果使用的细胞数少于500000个，请按照完整手册第16页的说明减少K-MetStat Panel的量。
17. 每个样品加入0.5 µg抗体。对于指定的对照反应，加入1µL IgG或H3K4me3对照抗体。轻轻涡旋混匀。
18. 在4ºC条件下，置于旋转混匀仪（nutator）上孵育过夜，管盖稍稍抬高。切勿翻转离心管。
第二天
第五部分：pAG-MNase结合（约40 min）
19. 将试剂槽放在冰上，注入冷的Cell Perm. Buffer。
20. 将离心管从4℃条件下取出，瞬时离心收集液体。注意：磁珠过夜可能沉淀，属正常现象。
21. 将离心管置于磁力架上，使溶液澄清，去除上清液。
22. 将离心管保留在磁力架上。每管加入200µL冷的Cell Perm. Buffer，用移液器去除上清液；此步骤重复一次。
23. 从磁力架上取下离心管。每管加入50µL冷的Cell Perm. Buffer，轻轻涡旋混匀。注意：磁珠在这个阶段可能会结块，可用移液器轻柔吹吸，使结块分散。
24. 每管加入2.5µL pAG-MNase。轻轻旋涡或用移液器吹吸，以重悬磁珠并使酶均匀分布。
25. 室温孵育10分钟。
26. 瞬时离心后，置于磁力架上，使溶液澄清，去除上清液。
27. 将离心管保留在磁力架上。每管加入200µL冷的Cell Perm. Buffer，用移液器去除上清液；此步骤重复一次。
28. 从磁力架上取下离心管。每管加入50µL冷的Cell Perm. Buffer。用移液器轻轻吹吸混匀、分散团块。
第六部分：目标染色质片段化（约3小时）
29. 将离心管置于冰上。每管加入1 μL 100 mM的氯化钙，轻轻涡旋或用移液器吹吸均匀。
30. 将离心管（管盖略微抬高）放在旋转混匀仪上4ºC孵育 2 小时。
31. 制备终止液：取1µL E. coli Spike-in DNA与33µL Stop Buffer混合（单个反应用量）。轻轻旋涡混匀。注意：如果使用的细胞数少于500,000个，请按照完整手册附录2中的说明稀释E. coli Spike-in DNA。
32. 孵育结束后，向每个反应中加入34 μL终止液，轻轻旋涡混匀。
33. 将反应离心管置于37℃热循环仪中，孵育10分钟。
34. 瞬时离心后，置于磁力架上，使溶液澄清。将含有DNA富集产物的上清液转移到新的8联排管中。丢弃含有ConA磁珠的离心管。
第七部分：DNA纯化（约30分钟）
35. 用无水乙醇（EtOH）和分子生物学级别的水制备85%乙醇（EtOH）（现用现配）。
36. 重悬SPRIselect试剂（Beckman Coulter, Inc），向每个反应管中缓慢加入119 µL。
37. 轻轻旋涡混匀，瞬时离心以收集液体。室温孵育5分钟。
38. 将离心管放在磁力架上2-5分钟。用移液器去除上清液，不要用移液管吸头搅动磁珠。
39. 将离心管保留在磁力架上。每管加入 180 µL 85% EtOH，用移液器去除上清液；此步骤重复一次。
40. 瞬时离心，管盖朝内，使磁珠留在离心管一侧。将离心管放回磁力架上，去除残留的EtOH。
41. 从磁力架上取下离心管，打开管盖。室温风干磁珠2-3分钟或直到液体蒸发，但磁珠仍然呈现潮湿的哑光棕色。如果磁珠有裂纹或呈浅棕色，说明过于干燥。
42. 每管加入17 µL 0.1X TE buffer洗脱DNA。
43. 涡旋重悬磁珠，室温孵育2分钟。
44. 将离心管置于磁力架上2分钟。将15µL CUT&RUN DNA转移到新的8联排管中。
45. 使用Qubit荧光仪对1 μL DNA进行浓度测定。继续文库制备或将DNA保存在-20ºC。
关于预期结果，可参阅完整手册。切勿使用TapeStation/Bioanalyzer检测 CUT&RUN DNA。DNA的产量太低，无法在这些平台上进行检测，而且在实验步骤的这一步也无法提供有用的信息。可等到文库制备后再检查片段分布。
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