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产品资料 – DNA聚合酶与扩增技术 – qPCR & RT-qPCR
LunaScript® 反转录预混液试剂盒（无引物） 收藏
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#E3025L
100 rxn
4,369.00
无
无
无
无
无
无
#E3025S
25 rxn
1,409.00
无
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产品特点
LunaScript® 反转录预混液试剂盒（无引物）是经过优化的 5X 预混液，包含除引物外第一链 cDNA 合成所需的所有组分。
·该 5X 预混液提供 Luna 反转录酶、dNTP 和小鼠 RNase 抑制剂。
·不含引物剂型可让用户更灵活的选择引物，以达到 cDNA 合成最佳效果
·15 分钟内即可完成第一链 cDNA 合成
·可用于第一链 cDNA 合成、两步法 RT-qPCR、两步法 RT-PCR以及 RNA-seq
·包含无干扰、可视化蓝色示踪染料，有助于减少加样错误
·提供 No-RT 对照预混液，增加实验可信度
产品说明
LunaScript® 反转录预混液试剂盒（无引物）包含经过优化后的 5X 预混液，以及除引物外第一链 cDNA 合成所需的所有组分。该预混液含有具备热稳定特性的 Luna 反转录酶，可在更高温下合成 cDNA。试剂盒还提供小鼠 RNase 抑制剂（保护模板 RNA 免受降解）和 dNTP。此外，组分中的蓝色示踪染料可为反转录和下游应用提供可视化示踪。
该预混液与随机引物、oligo dT 引物以及基因特异性引物兼容，让 cDNA 合成更灵活。LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物）合成的 cDNA 产物可用于多种下游应用。在实时定量 PCR 中，建议使用混有随机引物及 oligo dT 的混合引物合成 cDNA。与 LunaScript SuperMix 反转录试剂盒（NEB #E3010）一样，无论是 1 μg 总 RNA 还是低拷贝 RNA，该预混液均能提供稳健、线性和灵敏的检测。如需合成长片段或全长 cDNA，则建议使用 oligo dT 引物。仅需 55℃ 孵育 10 分钟，LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物）即可合成长达 9 kb 的 cDNA 产物。试剂盒还提供 No-RT 对照预混液，可快速建立对照反应体系。
图 1：三种 cDNA 合成试剂的区别：Supermix、预混液、cDNA 合成试剂盒
图 2：LunaScript 第一链 cDNA 合成时间最短，仅需 13 分钟
比较不同厂家的 cDNA 合成方案。LunaScript SuperMix 反转录试剂盒和 LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物）所需反应时间最短，并可以耐受高温，降低 RNA 复杂二级结构的影响。
图 3：LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物）支持多种下游应用
通过使用不同的引物（例如：随机引物混合液、d（T））23VN 引物或随机六聚体引物），LunaScript 反转录预混液试剂盒合成的 cDNA可适于不同下游应用（例如：RT-qPCR、RT-PCR 和 RNA-seq）。
图 4：在两步法 RT-qPCR 定量中，LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物）功效稳健
A．使用随机引物混合液（NEB #S1330）和 LunaScript 反转录预混液（无引物）对1 µg 至 100 pg RNA 进行反转录，并进行两步法 RT-qPCR 检测，结果显示：与 LunaScript （NEB #E3010）一致，合成 cDNA 产量均展现出良好的线性度。
B．对于常规转录本，使用 d（T）23VN 引物获得的 cDNA 覆盖度与随机引物混合液一致。但对于长转录本（例如：SMG1），随机引物混合液能更好地覆盖靶基因 5´端，右下角图框所示：RT-qPCR 的靶基因位于 SMG1（16 kb）转录本的 5´端；与随机引物混合液（随机六聚体引物和 dT 锚定引物的混合物）相比，单独使用 dT 锚定引物（d（T）23VN）的 Cq 值延迟
图 5：在两步法 RT-qPCR 中，LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物）性能更优异
A．根据各厂商产品说明书，使用几种市售第一链 cDNA 合成试剂盒将 1 μg–100 pg 人总 RNA 反转录成 cDNA，引物为随产品提供的随机引物。通过 8 个靶基因（丰度、长度和 GC 含
量不同）的 qPCR 结果对 cDNA 产物进行评估。使用 Luna 通用探针法 qPCR 预混液（NEB# M3004）对 cDNA 产物进行 qPCR 检测。结果评估了扩增效率和 ΔCq，其中 ΔCq 衡量低起始量检测和缺乏无模板对照（NTC）扩增（ΔCq=NTC 的平均 Cq-最低起始量的平均 Cq）。绿色框表示靶基因扩增表现（效率=90-110％，ΔCq≥3）。关于该可视化分析方法的详细信息，请在NEB 官网搜索“High-Throughput Data Analysis for qPCR”。
B．根据上述 4 个靶基因（两个经典内参基因和两个其它基因）的 Cq 值和上样量绘制曲线，结果显示：与其它商品化试剂盒相比，LunaScript 的 Cq 值最低。
图 6：在常规 PCR 或高保真 PCR 中，LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物）能够合成不同长度范围 cDNA
使用 LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物）将 1 μg Jurkat 总 RNA 反转录成 cDNA，引物为 d（T））23VN，使用标准反应条件 55℃ 孵育 10 分钟，95℃ 孵育 1 分钟。之后使用不同 PCR 扩增试剂对 cDNA 产物进行检测。对于 5 kb以内的常规应用，建议使用 OneTaq 2X 预混液（NEB #M0482）；对于高保真扩增，建议使用 Q5 热启动超保真 2X 预混液（NEB #M0494）；对于长片段高产量扩增，建议使用 LongAmp Taq 2X 预混液（NEB #M0287）（数据未显示）