Authenticase 切割错配核酸酶是一种专有的结构特异性核酸酶混合物，能够识别双链 DNA 上范围为 1-10 bp的错配和插入/缺失（indel）区域，并在其外侧进行切割。该配方可以限制对 DNA 同源双链区域的非特异性切割活性。Authenticase 切割错配核酸酶可作为一种在寡核苷酸的 PCR 基因组装过程中的修正试剂，在最后复性和扩增步骤之前，通过酶法去除“错误”（即去除由寡核苷酸合成引起的错配和插入/缺失（indel）错误）。另外，Authenticase 切割错配核酸酶可替代 T7 核酸内切酶 I 进行错配检测分析，用于评估基因组编辑效率。

 产品应用特色

 · 减少需要筛选的菌落数，从而节省时间

 ·  替代 T7 核酸内切酶 I 用于错配检测

 图1 Authenticase 切割错配核酸酶的作用机理

Authenticase 切割错配核酸酶是一种专有的结构特异性核酸酶混合物，能够识别双链 DNA 上范围为 1-10 bp的错配和插入/缺失（indel）区域，并在其外侧进行切割。该配方可以限制对 DNA 同源双链区域的非特异性切割活性。Authenticase 切割错配核酸酶可作为一种在寡核苷酸的 PCR 基因组装过程中的修正试剂，在最后复性和扩增步骤之前，通过酶法去除“错误”（即去除由寡核苷酸合成引起的错配和插入/缺失（indel）错误）。另外，Authenticase 切割错配核酸酶可替代 T7 核酸内切酶 I 进行错配检测分析，用于评估基因组编辑效率（其中 S1 是起始物质，P1 和 P2 是 Authenticase 切割错配核酸酶消化所得的产物）。

 

图3：相比 CorrectASE^™ 酶，Authenticase 切割错配核酸酶在降低错误率方面的表现更优

 

由 IDT^® 公司合成 16 种寡核苷酸（大小范围为 50-60 nt），用于扩增 MBD 基因（645 bp）。按照说明书建议，进一步处理 PCR 扩增子以降低片段中的错误率。使用 NEBuilder^® 高保真 DNA 组装克隆试剂盒 (NEB #E5520) 将经过错误修正的片段克隆到载体中，并利用筛选平板 (LB +amp) 分离菌落。每组实验均选取出 12 个 E. coli 菌落进行 DNA 质粒提取：1) 无酶处理； 2) 用 Authenticase 切割错配核酸酶处理；3) 用 CorrectASE^™ 处理，然后进行 Sanger DNA 测序。Authenticase 切割错配核酸酶将错误率从 645 bp 中 1 个错误降低到 1935 bp 中 1 个错误，而使用 CorrectASE 的错误率为 1,419 bp中 1 个错误。

 

图 4：突变检测：Authenticase 切割错配核酸酶 vs T7 核酸内切酶 I

 

比较使用 Authenticase 切割错配核酸酶和 T7 核酸内切酶 I 进行错配检测的效果。通过混合序列确定的 PCR 扩增子，然后加热并重新退火，人工创建含有各种错配或插入缺失（例如 A/C 错配、T/T 错配、2-bp 插入缺失等）的异源双链 DNA 库。这样就为每种测试的变体制备了具有预设突变率（约 21-25% 突变体和 75-79% 野生型）的异源双链底物。通过 Authenticase 切割错配核酸酶或 T7 Endo I 进行错配切割，并在 Agilent® Bioanalyzer® 上分析反应产物。根据观察到的切割产物和起始底物的摩尔浓度计算大约的突变率（切割百分比），然后绘制表示预期突变率的黑色实线参考线。Authenticase 切割错配核酸酶的性能与 T7 核酸内切酶 I 相当或更好。如果突变类型是单碱基或 2 bp 突变，Authenticase 切割错配核酸酶的检测效果优于 T7 核酸内切酶 I。如果突变类型是 indel（插入/删除）或超过 3 bp 的突变，Authenticase 切割错配核酸酶的检测效果与 T7 核酸内切酶 I 相当。