重组蛋白纯化系统Target tag/PA tag生物试剂-Wako富士胶片和光
| 供货周期 | 一个月以上 | 应用领域 | 生物产业 |
|---|
重组蛋白纯化系统Target tag/PA tag
重组蛋白纯化系统Target tag/PA tag
◆TARGET 标签系统 标签序列【(YPGQ)5V】
● 通过树脂再生，降低运作成本
● 温和洗脱、清洗，实现高纯度
● 在动物细胞表达系（HEK293T细胞、CHO细胞等）中有效纯化蛋白
TARGER标签系统使用的是可识别肽标签（21个氨基酸残基）的单抗（P20.1），是日本开发的亲和纯化标签系统。
TARGET标签系统实践证明，即使在传统系统都难以进行高纯度蛋白纯化的动物细胞表达系中，也可有效地进行亲和纯化。
TARGET标签系统
A rapid screening method for cell lines producing singly-tagged recombinant proteins using the“ TARGET tag”system. Tabata S. et al., J. Proteomics, 2010 Aug 5;73(9):1777-85.
TARGET 标签表达载体示意图
产品选择
|
载体 |
表达模式 |
宿主细胞 |
MCS启动子 |
|
pEBMulti |
非整合型稳定表达 |
灵长类（人、猴）、狗细胞等贴壁细胞 |
CAG |
|
pCAG |
瞬时表达 |
灵长类（人、猴）、狗细胞等贴壁细胞、大/小鼠等动物细胞 |
CAG |
和光还推出除上述抗性基因载体外的其他载体。（请点击查看）
测序用引物序列、其他载体序列的相关详细信息，已附在产品随货说明书中。
另外可点击和光主页/TARGET标签，查看序列信息、多克隆位点(MCS)信息。
|
TARGET标签融合蛋白的免疫沉淀
|
通过Transient 载体， 表达TARGET标签融合重组蛋白
|
|
培养上清（培养第7天） 每10 mL中，分别添加0.1 mL（net 0.05 mL）的抗体磁珠（①抗TARGET标签抗体琼脂糖珠、②抗DYKDDDDK标签抗体琼脂糖珠，其他公司产品），4℃条件下，进行2小时免疫沉淀。 清洗后，在回收的各珠中分别添加0.5 mL 0.2 mg/mL TARGET标签肽/TBS和0.2 mg/mL DYKDDDDK肽/TBS，4℃条件下，平稳震动0.5小时。离心后回收上清。 再分别在各珠中添加0.5 mL 0.1 M Glycine-HCl (pH 2.7)，室温下，平稳震动5分钟。离心后，回收上清并用1M Tris-HCl (pH 9.0)中和。 上图为SDS-PAGE处理后的银染结果。 与传统DYKDDDDK tag相比，背景更低 →高纯度！ |
M：M.W. Marker 1.仅转染载体的培养上清 2.转染了蛋白Y-TARGET 标签表达质粒的细胞培养上清 3.转染了TARGET标签-蛋白Y 表达质粒的细胞培养上清 也可使用市售的Transient载体 |
|
确认非整合型载体TARGET tag C端融合重组蛋白的表达 |
|
|
利用可编码表达人源生理活性蛋白基因的质粒转染HEK293N细胞后，从初期细胞数3×10^5cells/mL开始培养，回收0/3/7日的培养上清。 用20μL/lane的培养上清进行SDS-PAGE处理，通过银染和Western blotting，检测出蛋白的表达。 |
|
|
可确认到与市面售卖的Tag系统有相同的表达量和检测灵敏度。 |
|
TARGET 标签系列
|
产品名称 |
子类 |
适用 实验 |
规格 |
产品编号 |
包装 |
|
|
单抗 |
||||||
|
抗TARGET标签, 单抗 |
小鼠IgG1 |
IP, WB |
免疫化学用 |
016-25481 |
200 μg |
|
|
012-25483 |
1 mg |
|||||
|
HRP标签单抗 |
||||||
|
抗TARGET tag, 单抗, 过氧化酶结合 |
小鼠IgG1 P20.1 |
WB |
免疫化学用 |
015-25571 |
200 μL |
|
|
011-25573 |
1 mL |
|||||
|
产品名称 |
子类克隆号 |
规格 |
产品编号 |
包装 |
|||||
|
抗体结合琼脂糖珠 |
|||||||||
|
抗TARGET标签抗体琼脂糖珠 |
小鼠IgG1 P20.1 |
免疫化学用 | 018-25561 |
2 mL (Net 1 mL) |
|||||
| 014-25563 |
10 mL (Net 5 mL) |
||||||||
| 012-25564 |
50 mL (Net 25 mL) |
||||||||
|
识别N端、C端的TARGET标签 使用载体：4%琼脂糖 |
|||||||||
|
产品名称 |
备注 |
规格 |
产品编号 |
包装 |
|
肽 |
||||
|
TARGET标签肽 |
含量（HPLC）95%以上 |
基因研究用 |
200-19673 |
5 mg |
|
208-19674 |
25 mg |
|||
|
清洗液 |
||||
|
TARGET标签清洗液 |
已过滤消毒 |
基因研究用 |
208-19831 |
50 mL |
|
产品名称 |
可选Marker |
产品编号 |
包装 |
||
|
大肠杆菌 |
动物细胞 |
||||
|
瞬时表达载体 |
|||||
|
C端插入TARGET标签的pCAG-Ble载体 |
博莱霉素 |
165-26381 |
20 μg |
||
|
N端插入TARGET标签的pCAG-Ble载体 |
博莱霉素 |
162-26391 |
20 μg |
||
|
C端插入TARGET标签的pCAG-Bsd载体 |
杀稻瘟素S |
165-26401 |
20 μg |
||
|
N端插入TARGET标签的pCAG-Bsd载体 |
杀稻瘟素S |
162-26411 |
20 μg |
||
|
C端插入TARGET标签的pCAG-Hyg载体 |
潮霉素B |
169-26421 |
20 μg |
||
|
N端插入TARGET标签的pCAG-Hyg载体 |
潮霉素B |
166-26431 |
20 μg |
||
|
C端插入TARGET标签的pCAG-Neo载体 |
卡那霉素 |
G418 |
163-26441 |
20 μg |
|
|
N端插入TARGET标签的pCAG-Neo载体 |
卡那霉素 |
G418 |
160-26451 |
20 μg |
|
|
游离载体 |
|||||
|
C段插入TARGET标签的pEBMulti-Ble载体 |
博来霉素 |
167-26461 |
20 μg |
||
|
N段插入TARGET标签的pEBMulti-Ble载体 |
博来霉素 |
164-26471 |
20 μg |
||
|
C段插入TARGET标签的pEBMulti-Bsd载体 |
杀稻瘟素S |
161-26481 |
20 μg |
||
|
N段插入TARGET标签的pEBMultI-Bsd载体 |
杀稻瘟素S |
168-26491 |
20 μg |
||
|
C段插入TARGET标签的pEBMulti-Hyg载体 |
潮霉素B |
161-26501 |
20 μg |
||
|
N段插入TARGET标签的pEBMulti-Hyg载体 |
潮霉素B |
168-26511 |
20 μg |
||
|
C段插入TARGET标签的pEBMulti-Neo载体 |
卡那霉素 |
G418 |
165-26521 |
20 μg |
|
|
N段插入TARGET标签的pEBMulti-Neo载体 |
卡那霉素 |
G418 |
162-26531 |
20 μg |
|
|
C段插入TARGET标签的pEBMulti-Puro载体 |
氨苄青霉素 |
嘌呤霉素 |
169-26541 |
20 μg |
|
|
N段插入TARGET标签的pEBMulti-Puro载体 |
氨苄青霉素 |
嘌呤霉素 |
166-26551 |
20 μg |
|
◆PA标签系统 标签序列【GVAMPGAEDDVV】
● 通过树脂再生，降低运行成本
● 超高亲和性抗体，实现高回收率、高纯度纯化
● 在动物细胞表达系（HEK293T细胞、CHO细胞等）中，有效纯化蛋白
● PA标签系统是使用可识别肽标签（12个氨基酸残基）的单抗（NZ-1）。日本开发的亲和性纯化标签系统。
● NZ-1单抗对PA tag具有高亲和性和特异性，可应用于Western Blotting、细胞流式分析、免疫组化（ICC）。
通过免疫沉淀，可纯化PA标签融合蛋白以及树脂再生。
● PA标签系统，可一步纯化高纯度PA标签融合蛋白。
PA标签系统
Fujii, Y. et al., “PA tag: A versatile protein tagging system using a super high affi nity antibody against a dodecapeptide derived from human podoplanin.”, Protein Exp. Purif., 95, 240-247(2014).
Fujii, Y. et al.
新型亲和标签系统“PA tag”的应用方法~蛋白的纯化及检测~
蛋白科学学会档案, 7, e075 (2014)
PA标签表达载体案例
|
载体 |
表达模式 |
宿主细胞 |
MCS启动子 |
|
pCAG |
瞬时表达 |
灵长类（人、猴）、犬细胞等粘着细胞 |
CAG |
和光还推出除上述抗性基因载体外的其他载体。（请点击参考。）
测序用引物序列、其他载体序列的相关详细信息，已附在产品现货说明书中。
另外可点击和光主页/TARGET标签，查看序列信息、Multi Cloning Site(MCS)信息。
用PA标签从培养上清中亲和提纯的案例
数据提供：大阪大学 蛋白研究所附属蛋白分析先进研究中心
分子创制学研究室 高木淳一老师，藤井勇树老师
Protocol 目的蛋白的纯化
１．哺乳类动物细胞转染(HEK293T)
转染处于40-60%融合状态的细胞
培养基：D-MEM, 5%FBS
２．回收培养上清和吸附蛋白树脂
转染48-72小时后，回收约420 mL培养上清，加入8 mL抗PA标签抗体琼脂糖珠，混合2小时（2-10℃）
３．树脂回收
用50 mL的纯化柱。回收步骤2)中的琼脂糖珠
４．树脂洗涤
加入珠4倍量的TBS 缓冲液（20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl），清洗5次
５．PA标签肽从树脂中竞争性洗脱
加入经1×TBS溶液, pH 7.5溶解过的PA 标签肽（终浓度0.1 mg/mL），体积量需为珠的一倍，
然后分10次回收PA标签融合蛋白X
６．SDS-PAGE
样品量
c. sup：5 μL, flow through：5 μL, wash：5 μL,
肽洗脱（1-10）：各10 μL
可纯化PA标签融合蛋白X且不依赖PA标签。→可实现*纯度的亲和纯化。
通过PA tag降低背景的方法
|
|
M: Marker |
在20 mL的昆虫细胞溶解液中加入蛋白Z，使其浓度变为1.0 mg/L后，添加200 μL抗PA标签抗体琼脂糖珠，4℃温度条件下，搅拌3小时。
分别用不同浓度的TBS溶液（0.15 M、0.5 M、1.0 M NaCl）进行调整，用琼脂糖珠50倍量清洗。在回收的各珠中加入0.5 mL 0.1 M Glycine-HCl(pH 2.7)，室温条件下平稳震动5 min。
离心后回收上清，用1 M Tris-HCl (pH 9.0)做中和处理。
SDS-PAGE后进行银染，比较去除污染蛋白之后，不同浓度下的结果。
使用案例：Western Blotting
|
地域革新领域 加藤 幸成老师，金子 美华老师 NZ-1显示出与天然抗体具有相同的高检测灵敏度。 |
Lane 1 一抗：抗IDH1抗体（RcMab-1）, 1 μg/mL 二抗：抗大鼠IgG-HRP标签, 1000倍稀释 一抗：抗PA tag抗体, 1 μg/mL 二抗：抗大鼠IgG-HRP标签, 1000倍稀释 一抗：抗DYKDDDDK标签抗体, 3.5 μg/mL 二次抗体：抗小鼠IgG-HRP标签, 1000倍稀释 |
PA标签系列
|
产品名称 |
子类克隆号 |
适用实验 |
规格 |
产品编号 |
包装 |
|
单抗 |
|||||
|
抗PA标签, 大鼠单抗 |
大鼠IgG2a |
IP, WB, FCM, ICC |
免疫化学用 |
016-25861 |
200 μL |
|
012-25863 |
1 mL |
||||
|
HRP标签单抗 |
|||||
|
抗PA标签, 大鼠单抗,过氧化酶结合 |
大鼠IgG2a NZ-1 |
WB |
免疫化学用 |
015-25951 |
200 μL |
|
011-25953 |
1 mL |
||||
|
产品名称 |
子类克隆号 |
规格 |
产品编号 |
包装 |
|
抗体结合琼脂糖珠 |
||||
|
抗PA标签抗体琼脂糖珠 |
大鼠IgG2a NZ-1 |
免疫化学用 |
012-25841 |
2 mL(Net 1 mL) |
|
018-25843 |
10 mL (Net 5 mL) |
|||
|
016-25844 |
50 mL (Net 25 mL) |
|||
|
识别N端、C端的PA标签 |
||||
|
抗体结合磁珠 |
||||
|
MagCaptureTM HP 抗PA标签抗体磁珠 |
大鼠IgG2a NZ-1 |
免疫化学用 |
137-18751 |
2 mL |
|
溶液组成：1×TBS(pH 7.4), 50% glycerol, 0.05 w/v% sodium azide |
||||
|
产品名称 |
备注 |
规格 |
产品编号 |
包装 |
|
肽 |
||||
|
PA标签肽 |
含量（HPLC）95%以上 |
基因研究用 |
167-25501 |
5 mg |
|
163-25503 |
25 mg |
|||
|
清洗溶液 |
||||
|
PA标签清洗溶液 |
已过滤消毒 |
基因研究用 |
169-27261 |
50 mL |
|
产品名称 |
可选Marker |
产品编号 |
包装 |
|
|
大肠杆菌 |
动物细胞 |
|||
|
瞬时载体 |
||||
|
pCAG-Ble PA 标签-C |
Bleomycin |
161-26861 |
20 μg |
|
|
pCAG-Ble PA 标签-N 信号 增加型 |
Bleomycin |
168-26871 |
20 μg |
|
|
pCAG-Bsd PA 标签-C |
Blasticidin S |
165-26881 |
20 μg |
|
|
pCAG-Bsd PA 标签-N 信号 增加型 |
Blasticidin S |
162-26891 |
20 μg |
|
|
pCAG-Neo PA 标签-C |
Hygromycin B |
165-26901 |
20 μg |
|
|
pCAG-Hyg PA 标签-N 信号 增加型 |
Hygromycin B |
162-26911 |
20 μg |
|
|
pCAG-Neo PA 标签-C |
Kanamycin |
G418 |
169-26921 |
20 μg |
|
pCAG-Neo PA 标签-N 信号 增加型 |
Kanamycin |
G418 |
166-26931 |
20 μg |