WB 实验常见问题及问题排除
| WB 实验结果有黑点 | |
| 原因 | 解决方案 |
| 封闭液未溶解完全 | a. 确认奶粉完全溶解。出现黑点最常发生的原因是奶粉没有完全溶解，建议加入搅拌子，增加搅拌时间，或是溶解后离心取上清液使用。 b. 利用0.45 um的滤纸过滤溶液，以除去未溶解的牛奶颗粒及其他杂质。 c. 改变封闭液的种类，如换为BSA。 |
| 溶液污染 | a. 使用新鲜配制的溶液 （跑胶、转膜、封闭、洗脱等缓冲液）或商业化溶液，以减少因长菌长霉造成的黑点。 b. 确认一抗溶液是否保存不当，可尝试重新配置一抗溶液。 |
| 封闭液及抗体交互作用 | 一般脱脂牛奶中含有casein这种磷酸蛋白，可能会与磷酸化抗体产生非特异性结合，因此，如使用磷酸化抗体，建议用BSA作为封闭溶液，同时洗脱溶液也用TBST，如此可降低黑点或高背景值状况。 注：a. TBST是以Tris为基底，PBST是以磷酸盐为基底的缓冲液，一般根据习惯选择使用TBST或PBST。但如果是操作磷酸化抗体或最终显色分析是用AP系统时，因为PBST中的磷酸根会干扰，可能会造成高背景值或无信号，此时建议使用TBST缓冲液。另外，同一次实验中请使用一种缓冲液，不可封闭液用PBST，洗脱液用TBST。 b. 封闭时一般使用3-5%封闭溶液，依实验特性不同，可做微调；牛奶与BSA的选择也是相同，掌握原则后，再依实验特性做微调，就能快速上手。 |
| WB实验结果信号过曝 | |
| 原因 | 解决方案 |
| 蛋白样品过量 | 降低蛋白上样量。通常蛋白上样量为30-50 ug，但有些蛋白的表达量较高（如beta actin），此时可依蛋白表现量，调整上样量。 |
| 抗体过量 | a. 提高抗体稀释倍数。产生过曝时可提高一抗、二抗的稀释倍数。 b. 减少孵育时间 c. 于4℃孵育 |
| 信号过曝 | a. 缩短曝光时间。过曝时可缩短曝光时间，减少过曝的情形。 b. 使用低灵敏度的化学发光底物。过曝现象也有可能是因为化学发光底物过强导致的, 可选用灵敏度较低的化学发光底物来改善。 注：化学发光底物一般有三种等级，femto（飞克, 10-15g）， pico（皮克, 10-12g）, 及plus（低皮克级, 10-12~ 10-9g），可依蛋白表达量挑选适合的化学发光底物。 |
| WB实验结果拖带 | |
| 原因 | 解决方案 |
| 样本不纯，有杂质污染 | a. 重新离心样品后取上清液使用 b. 使用较纯的试剂配置细胞裂解液或购买商业化产品 c. 使用Benzonase®核酸酶。Benzonase®核酸酶能迅速水解核酸，降低蛋白样品粘度，减少核酸对跑胶的干扰 d. 全细胞或亚细胞萃取。使用商业化全细胞或亚细胞萃取试剂盒提取蛋白样品，减少配制试剂溶液以及操作中分离不干净的问题。 |
| 蛋白样品过量 | a. 降低蛋白上样量。通常蛋白上样量为30-50ug，但有些蛋白表达量较高(如beta actin)，此时可依蛋白表达量，进行微调。 b. 延长加热时间。蛋白变性不完全, 也会使条带成团拖尾，此时可通过延长样品加热时间（一般约5分钟）及调整SDS（一般是2 %）比例, 使蛋白变性更完全。 |
| 信号过曝 | a. 缩短曝光时间。过曝时可缩短曝光时间, 减少过曝的情形。 |
| b. 使用低灵敏的化学发光底物。过曝现象可能是因为化学发光底物过强导致的, 可选用灵敏度较低的化学发光底物来改善。 | |
| WB条带扭曲 | |
| 原因 | 解决方案 |
| 胶没配置好 | a. 确保APS & TEMED 正常, 并新鲜配置胶体。 APS为起始剂，主要负责提供自由基供胶体进行聚合反应， APS粉末容易受潮，建议置于防潮箱保存，如果发生结块，建议重新购买。TEMED为催化剂，如果保存不当或过期，也会影响胶体聚合，建议分装。 b. 小心移除齿梳，避免造成加样壁孔歪斜 c. 配完下层胶后，需用水或醇类将胶体压平 d. 胶里面有杂质/气泡。可预先用0.45 um滤纸过滤胶体溶液，混合胶体溶液时，应避免产生气泡。 |
| 电流电压问题 | a. 避免用高电压电泳使胶体过热。 150V，过热有雾气，80-100V，上胶带短、下层不匀。 b. 空的孔道加样品缓冲液，使每个孔洞都有样品且盐类成分相近。 c. 避免孔洞中有杂质，用高纯度等级的化学药品或用商业化试剂提取蛋白样品，或在上样前用跑胶缓冲溶液冲洗加样孔。 |
| 转膜问题 | a. 胶体应与膜密合，转膜时小心滚压胶体，使胶体与膜贴合紧实 b. 转膜时小心勿晃动。有时出现 2个条带是因为转膜时发生晃动，产生叠影 条带呈哑铃状 出现哑铃最大的可能是胶没有配置好，胶凝固后不均一，拔完梳子之后，某些孔道凸起不平整，可以试着注意胶体是否凝固完全（确认试剂没问题），拔梳子时注意不要让孔道歪掉，loading前也可以再用running buffer冲洗孔道，另外还有一种可能是样品中含有太多杂质，没有离心下来，或没有溶解，然后杂质沉积在孔的中间，蛋白因此被推挤到两边。 |
| 条带呈哑铃状 | 原因：出现哑铃状最可能是胶没有配制好，胶凝固后不均，拔完齿梳之后，某些孔道凸起不平整，另一种可能是样品中含有过多杂质，没有离心下来，或没有溶解，导致杂质沉积在孔的中间，蛋白因此被推挤到两边。 解决方案：确认胶体是否凝固完全，拔齿梳时注意不要让孔道歪斜，上样前可再用跑胶缓冲液冲洗孔道。 |
| WB背景值较高 | |
| 原因 | 解决方案 |
| 封闭不足 | a. 提高封闭液浓度，确保封闭液完全覆盖转印膜，如使用5% 脱脂奶粉或BSA。 b. 增加封闭时间，一般情况会使用37℃封闭1小时，可视情况调整封闭的条件。 c. 使用BSA作为封闭液，同时搭配使用TBST的洗脱液来降低高背景值的状况。 |
| 抗体问题 | a. 抗体浓度太高。建议降低抗体浓度，并增加洗涤次数和时间。 b. 一抗孵育温度过高，建议4℃孵育过夜。 c. 二抗的非特异性背景，可增加二抗对照，以阳性对照组确认二抗。 d. 洗脱不足，增加洗脱液体积和洗涤次数。 |
| 显色问题 | 化学发光底物过多，建议调整化学发光底物，按说明书加入适量的显色底物。也可依据蛋白表达量的不同，选择合适的化学放光底物。 |
| 膜的问题 | a. 挑选合适的NC或PVDF膜。依据靶标蛋白、想要呈现的实验结果及膜的特性，选择出适合实验的材料。 b. 建议实验过程中都必须注意让膜保持湿润，特别是PVDF膜。 c. 在使用PVDF膜时可能会出现浸润不均匀的情况，从而导致背景值比较高的情况。因此，建议使用PVDF膜前使用100% methanol完全浸润膜。 |
| WB条带非专一性 | |
| 原因 | 解决方案 |
| 蛋白质降解 | a. 蛋白质抑制剂或磷酸酶抑制剂 b. 冰上操作 c. 避免反复冻融 |
| 蛋白质形成多聚糖 | a. 使用现配的DTT/2-ME，并将加热时间延长 b. 确认样本煮沸时的温度达到95-100℃ |
| 确认蛋白质特性 | 查询生物信息确认蛋白是否存在后修饰、剪切体等。 |
| 抗体浓度过高或蛋白样品过量 | a. 调整蛋白上样量为30-50 ug或减少上样量 b. 增加抗体稀释倍数 |
| 抗体非专一性结合 | a. 增加洗膜次数与除垢剂强度 b. 设对照组确认抗体专一性 c. 询问抗体公司技术支持 |
| 抗体认到轻重链的信号 | a. 换不同宿主来源的一抗 b. 使用EasyBlot二抗 |
| 目标信号微弱 | |
| 原因 | 解决方案 |
| 蛋白问题 | a. 了解靶标蛋白的特性 Ø 是否存在特异性? 可提取特定细胞器增加蛋白浓度，例：抽取核蛋白、膜蛋白、胞质蛋白。 Ø 是否存在组织特异性? 有些目标蛋白只会在特定组织表达，这可降低样本挑选的错误率。 Ø 是否有后修饰作用? 目标蛋白后修饰分子量会变大，使抗体认到的位置比估算分子量高。 Ø 确认靶标蛋白在细胞株的表达量以及是否需加药诱导蛋白表达。 b. 增加蛋白质上样量。一般蛋白上样量为20-30μg/孔, 如文献已表明靶标蛋白表达量低或是使用极少的上样量（例如< 10μg），需增加上样量来协助抗体侦测其信号。 c. 减少蛋白降解。 Ø 细胞萃取时要加蛋白质抑制剂或磷酸酶抑制剂，避免蛋白降解。 Ø 在冰上操作蛋白质实验。 Ø 避免反复冻融样品(建议分装)。 Ø 新鲜制备新一批的样本。 |
| 抗体问题 | a. 调整抗体孵育条件。 Ø 增加抗体量，例如原本使用1:1000稀释，调整为1:500稀释。 Ø 增加孵育时间：将原37℃孵育1小时改成4℃孵育过夜。 b. 一抗二抗不相容。检查二抗与一抗种属是否有正确配对，要诀：“鼠配鼠兔配兔，isotype相配不出错”。 c. 过度洗脱。减少洗脱次数与时间：一般洗脱三次, 每次5-10分钟即可。 |
| 转膜问题 | a. 检查转膜方向。转膜方向错误会让蛋白往反方向移动散逸在转膜缓冲液里，方向正确才能让蛋白粘附咋转印模的孔洞里。 b. 根据分子量调整转膜条件。大分子蛋白转膜条件可调整为低温过夜（湿式转膜），小分子蛋白改用0.2 um的转印膜，缩短转膜时间。 |
| 封闭过度 | a. 降低封闭液浓度：一般使用3-5%的牛奶或BSA做封闭液即可。 b. 降低封闭时间：一般封闭时间为30-60分钟。 c. 换封闭液，可使用商业化封闭液（GTX30963）可协助避免这个问题的发生。 |
| 化学发光底物失活或敏感度不够 | a. 使用现配的化学发光底物 b. 使用高敏感度的化学发光底物，例如使用飞克（GTX14698）等级的化学发光底物。 c. 增加曝光时间 |
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